Denaturerende gradient gelelektroforese med multilocus-sekventypning af Staphylococcus aureus-isolater

For at undgå behovet for multilocus-sekventering blev der udviklet en metode, der anvender denaturerende gradient gelelektroforese (DGGE) til multilocus-sekventypning (MLST) af Staphylococcus aureus-isolater. Sekvenstyperne (ST’er) blev opnået på grundlag af sekvenser af polymerasekædereaktions (PCR)-produkter fra syv husholdningsgener og sammenlignet med MLST-referencedatabasen. Smeltkurverne, sekvenserne og DGGE-profilerne blev sammenlignet for 100 ST’er (i) for at bestemme PCR-betingelserne med 40-mer GC-klamper knyttet til de fremadrettede og omvendte primere, (ii) for at vælge enkelte restriktionsenzymsteder til fordøjelse af PCR-produkterne i to fragmenter med hver en GC-klamp knyttet og (iii) for at optimere DGGE-betingelserne. Da DGGE-typerne (DT) blev analyseret, blev størstedelen af DT’erne (76/100) nøjagtigt klassificeret i én ST (95 % af nukleotidændringerne blev påvist), 10 DT’er blev klassificeret i en af to ST’er svarende til en enkelt nukleotidtvetydighed, og 14 DT’er blev klassificeret i 3 eller 4 ST’er svarende til 4 eller 5 nukleotidtvetydigheder. En kombination af ST’er og DT’er blev anvendt til at opnå septuplet-sæt af ST’er (7-ST) for 25 S. aureus-isolater. Ved sammenligning med reference-MLST-databasen havde et methicillinresistent S. aureus-isolat (MRSA) den samme genotype som den første MRSA-klon. DGGE-MLST-metoden kan anvendes som en hurtig, præcis og 20 gange billigere metode end DNA-sekventering til påvisning af alle sekvenstyper. Denne kombinerede laboratorie- og in silico-metode kan have en bred anvendelighed, ikke kun i forbindelse med MLST-metoder for andre bakterier, men også i forbindelse med screening af multilocus-nukleotidforskelle, der er deponeret i andre mutationsdatabaser.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.