Denaturoivan gradienttigeelielektroforeesin avulla tapahtuva multilokus-sekvenssityypitys Staphylococcus aureus -isolaattien avulla

Monilokus-sekvenssityypitystä (multilocus sequencing) varten kehitettiin denaturoivalla gradienttigeelielektroforeesilla tehtävä menetelmä Staphylococcus aureus -isolaattien monilokus-sekvenssityypitykseen. Sekvenssityypit (ST) saatiin polymeraasiketjureaktiotuotteiden (PCR) sekvenssien perusteella seitsemästä housekeeping-geenistä, ja niitä verrattiin MLST-viitetietokantaan. Sulatuskäyriä, sekvenssejä ja DGGE-profiileja verrattiin 100 ST:n osalta i) PCR-olosuhteiden määrittämiseksi siten, että eteen- ja taaksepäin suuntautuviin alukkeisiin oli liitetty 40-mer GC-kiinnittimiä, ii) yksittäisten restriktioentsyymikohtien valitsemiseksi PCR-tuotteiden pilkkomista varten kahdeksi fragmentiksi, joista kumpaankin oli liitetty GC-kiinnitin, ja iii) DGGE-olosuhteiden optimoimiseksi. Kun DGGE-tyypit (DT) analysoitiin, suurin osa DT:istä (76/100) luokiteltiin tarkasti yhteen ST:hen (95 prosenttia nukleotidimuutoksista havaittiin), 10 DT:tä luokiteltiin yhteen kahdesta ST:stä, mikä vastasi yhtä nukleotidien epäselvyyttä, ja 14 DT:tä luokiteltiin kolmeen tai neljään ST:hen, mikä vastasi neljää tai viittä nukleotidien epäselvyyttä. ST:iden ja DT:iden yhdistelmää käytettiin 25 S. aureus -isolaatin ST:iden septuplettisarjojen (7-ST) saamiseksi. Verrattaessa MLST-viitetietokantaan yhdellä metisilliinille resistentillä S. aureus (MRSA) -isolaatilla oli sama genotyyppi kuin ensimmäisellä MRSA-kloonilla. DGGE-MLST-menetelmää voidaan käyttää nopeana, tarkkana ja 20 kertaa edullisempana menetelmänä kuin DNA-sekvensointia kaikkien sekvenssityyppien osoittamiseen. Tätä yhdistettyä laboratorio- ja in silico -menetelmää voitaisiin soveltaa laajalti paitsi muiden bakteerien MLST-menetelmiin myös muihin mutaatiotietokantoihin talletettujen monen fokuksen nukleotidierojen seulontaan.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.