Denaturační gradientová gelová elektroforetická multilokusová sekvenční typizace izolátů Staphylococcus aureus

Pro odstranění nutnosti multilokusového sekvenování byla vyvinuta metoda denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE) pro multilokusovou sekvenční typizaci (MLST) izolátů Staphylococcus aureus. Sekvenční typy (ST) byly získány na základě sekvencí produktů polymerázové řetězové reakce (PCR) ze sedmi housekeepingových genů a porovnány s referenční databází MLST. Křivky tání, sekvence a DGGE profily byly porovnány pro 100 ST i) za účelem stanovení podmínek PCR se 40-merovými GC-svorkami připojenými k přednímu a reverznímu primeru; ii) za účelem výběru jednotlivých míst restrikčních enzymů pro štěpení produktů PCR na dva fragmenty, každý s připojenou GC-svorkou, a iii) za účelem optimalizace podmínek DGGE. Při analýze typů DGGE (DT) byla většina DT (76/100) přesně zařazena do jednoho ST (bylo zjištěno 95 % nukleotidových změn), 10 DT bylo zařazeno do jednoho ze dvou ST odpovídajících jedné nukleotidové nejasnosti a 14 DT bylo zařazeno do 3 nebo 4 ST odpovídajících 4 nebo 5 nukleotidovým nejasnostem. Kombinace ST a DT byla použita k získání septupletových sad ST (7-ST) pro 25 izolátů S. aureus. Při porovnání s referenční databází MLST měl jeden izolát S. aureus rezistentní vůči meticilinu (MRSA) stejný genotyp jako první klon MRSA. Metodu DGGE-MLST lze použít jako rychlou, přesnou a 20krát levnější metodu než sekvenování DNA pro detekci všech typů sekvencí. Tento kombinovaný laboratorní a in silico přístup by mohl mít širokou použitelnost nejen pro metody MLST pro jiné bakterie, ale i pro screening multilokusových nukleotidových rozdílů uložených v jiných mutačních databázích.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.