Denaturing gradient gel electrophoretic multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates

Staphylococcus aureus isolatesについて多座配列決定を必要としないDGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) による多座配列タイピング(MLST)を考案し、その方法として、SGGEを使用した。 7つのハウスキーピング遺伝子からのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物の配列を基に配列型(ST)を求め、参照MLSTデータベースと比較した。 メルトカーブ、配列、DGGEプロファイルを100 STsについて比較し、(i) フォワードおよびリバースプライマーに40-merのGCクランプを付けたPCR条件を決定し、(ii) PCR産物をGCクランプを付けた2つのフラグメントにそれぞれ消化する単一制限酵素サイトを選び、 (iii) DGGE条件を最適化するために、DGGEプロフィールを行った。 DGGEタイプ(DT)を解析したところ、大半のDT(76/100)は1つのSTに正確に分類され(95%のヌクレオチド変化が検出された)、10個のDTは1つのヌクレオチドのあいまいさに対応して2つのSTのいずれかに、14個のDTは4または5ヌクレオチドのあいまいさに対応して3または4STに分類された。 STとDTを組み合わせて、25株の黄色ブドウ球菌のSTの7重セット(7-ST)を得た。 参考MLSTデータベースと比較したところ,1株のmethicillin-resistant S. aureus(MRSA)が最初のMRSAクローンと同じ遺伝子型を持っていた. DGGE-MLST法は、すべての配列タイプの検出において、DNAシーケンシングよりも迅速かつ正確で、20倍安価な方法として使用することができます。 この実験室とin silicoを組み合わせた手法は、他の細菌のMLST法だけでなく、他の変異データベースに寄託された多座核酸の差異のスクリーニングにも広く応用できる可能性がある。

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