Tiparea secvenței de secvență multilocus prin electroforeză în gel cu gradient de denaturare a izolatelor de Staphylococcus aureus

Pentru a evita necesitatea secvențierii multilocus, a fost dezvoltată o metodă care utilizează electroforeza în gel cu gradient de denaturare (DGGE) pentru tipizarea secvenței multilocus (MLST) a izolatelor de Staphylococcus aureus. Tipurile de secvențe (ST) au fost obținute pe baza secvențelor produselor reacției în lanț a polimerazei (PCR) din șapte gene de menținere și au fost comparate cu baza de date MLST de referință. Curbele de topire, secvențele și profilurile DGGE au fost comparate pentru 100 de ST (i) pentru a determina condițiile de PCR cu cleme GC de 40 de meri atașate la amorsele înainte și înapoi; (ii) pentru a alege situsurile unei singure enzime de restricție pentru digestia produselor PCR în două fragmente, fiecare cu o clemă GC atașată și (iii) pentru a optimiza condițiile DGGE. Atunci când au fost analizate tipurile DGGE (DT), majoritatea DT (76/100) au fost clasificate cu exactitate într-o singură ST (au fost detectate 95 % din modificările nucleotidelor), 10 DT au fost clasificate într-una dintre cele două ST corespunzătoare unei singure ambiguități nucleotidice și 14 DT au fost clasificate în 3 sau 4 ST corespunzătoare la 4 sau 5 ambiguități nucleotidice. O combinație de ST și DT a fost utilizată pentru a obține seturi septuplete de ST (7-ST) pentru 25 de izolate de S. aureus. În comparație cu baza de date MLST de referință, un izolat de S. aureus rezistent la meticilină (MRSA) avea același genotip ca și prima clonă MRSA. Metoda DGGE-MLST poate fi utilizată ca o metodă rapidă, precisă și de 20 de ori mai puțin costisitoare decât secvențierea ADN pentru detectarea tuturor tipurilor de secvențe. Această abordare combinată de laborator și in silico ar putea avea o aplicabilitate largă nu numai la metodele MLST pentru alte bacterii, ci și la depistarea diferențelor nucleotidice multilocus depozitate în alte baze de date de mutații.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.