Diskussion
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen zum ersten Mal die Schlüsselrolle der Ergosterin-Synthese bei der Resistenz von Hefen gegen Trocknungs-/Befeuchtungsbehandlungen (Abb. 2). Der Ersatz von Zymosterin, dem frühesten Sterol der in dieser Studie getesteten EBP (erg6Δ-Stamm), durch Ergosterin ermöglichte die Wiederherstellung der Resistenz auf das beim WT-Stamm beobachtete Niveau (Tabelle 2). Die wichtigsten chemischen Umwandlungen, die während des Biosyntheseprozesses von Zymosterin zu Ergosterin stattfinden, sind eine Veränderung der Sättigung des B-Rings und des aliphatischen Schwanzes (Abb. 1B). Diese allmählichen Veränderungen könnten zur Optimierung der biophysikalischen Eigenschaften der Moleküle in den nachfolgenden Schritten des EBP beitragen und den Anstieg der Resistenz gegenüber Trocknungs-/Befeuchtungszyklen erklären. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die drei am frühesten getesteten Mutanten (erg6Δ, erg2Δ und erg3Δ) sehr empfindlich auf Trocknung/Befeuchtung reagieren. Die erste Unterbrechung in der Zunahme des Widerstands entlang des EBP wurde bei der Sorte erg5Δ festgestellt. Diese nahm mit erg4Δ schrittweise zu und erreichte mit dem WT-Stamm einen Maximalwert (Abb. 2). Die chemischen Strukturen der wichtigsten Sterole, die von den drei letztgenannten Stämmen gebildet werden, sind durch das Vorhandensein von zwei Doppelbindungen im B-Ring gekennzeichnet (Abb. 1B). Bei einem Radikalangriff ermöglichen diese konjugierten Doppelbindungen die Stabilisierung von Sterolradikalen durch Resonanz (Delokalisierung des ungepaarten Elektrons). Diese chemische Eigenschaft könnte die positive Wirkung auf das Überleben bei Trocknung/Befeuchtung erklären, die mit Oxidation einhergeht (Garre et al. 2010), indem sie Phospholipide auf dieselbe Weise wie Vitamin E vor Peroxidation schützt (Packer 1991). Die wichtigsten Sterole, die von den drei Stämmen mit Mutationen zu Beginn des EBP akkumuliert werden, besitzen eine einzigartige doppelte C-C-Bindung an der C-7,8- oder C-8,9-Position, weit entfernt von der Hydroxylgruppe, die die Stabilisierung des Radikals durch Resonanz nicht fördert. Dies könnte die hohe Empfindlichkeit der erg6Δ-, erg2Δ- und erg3Δ-Stämme gegenüber der Trocknung unter atmosphärischer Luft erklären. Die progressive Zunahme der Resistenz gegen Ende des EBP (Abb. 2), die bei den erg5Δ-, erg4Δ- und WT-Stämmen beobachtet wurde, könnte mit den Unterschieden zwischen den aliphatischen Schwänzen der Sterole zusammenhängen (Abb. 1B). Die Schwanzstruktur beeinflusst nämlich die Planarität der Sterole, die für ihre Position in der Membran entscheidend ist (Xu und London 2000; Bakht und London 2006). Somit könnten die letzten Schritte des Ergosterolwegs eine bessere Anpassung des Sterols an die Membran ermöglichen, indem Parameter wie die Tiefe innerhalb der Lipiddoppelschicht verändert werden, um den Schutz der Phospholipide vor Oxidation zu optimieren. Der Sterol-vermittelte Schutz von Lipiden vor Oxidation wurde bereits an Modellmembranen (Wiseman 1993), aber noch nie an biologischen Zellen nachgewiesen. Unsere Ergebnisse zeigen zum ersten Mal eine Beziehung zwischen der Art der Sterine und der Oxidationsbeständigkeit. Sie stützen auch eine Hypothese, die besagt, dass Sterole den Zellen Widerstand gegen Oxidation verliehen haben könnten, als der Sauerstoffgehalt während der Oxygenierung der Erde anstieg (Galea und Brown 2009; Brown und Galea 2010). In der Tat kommen die Autoren dieser Studie zu dem Schluss, dass die Synthese von Sterolen, ein sauerstoffabhängiger Prozess (Abb. 1A), eine adaptive Reaktion auf den Anstieg des terrestrischen Sauerstoffs gewesen sein könnte.
Trocknungsexperimente unter Stickstoff führten bei allen getesteten Stämmen zu höheren Überlebensraten als Experimente mit Lufttrocknung (Abb. 2). Die Auswirkung der Abwesenheit von Sauerstoff während der Trocknung war bei den Stämmen mit Mutationen in frühen Komponenten des EBP stark, nahm bei denen mit Mutationen in späteren Komponenten des EBP ab und war beim WT-Stamm gering. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Oxidation eine wichtige Rolle bei der tödlichen Wirkung der Trocknung unter atmosphärischen Bedingungen spielt. Da jedoch die Sterblichkeitsrate bei erg6Δ, erg2Δ, erg3Δ und erg5Δ auch bei der Trocknung unter Stickstoff beträchtlich blieb, schließen wir daraus, dass andere Faktoren als die Oxidation zum Zelltod während der Trocknung beitragen. Einer dieser Faktoren könnte eine starke mechanische Beanspruchung der Plasmamembran sein, die aus dem Wasserverlust der Zellen durch osmotischen Transfer resultiert (Dupont et al. 2010). Es ist bekannt, dass die Beschaffenheit der Sterole die Eigenschaften der Plasmamembran beeinflusst, wie z. B. die Fluidität (Abe und Hiraki 2009) und die Art der Verformung (Bacia et al. 2005; Dupont et al. 2011). Diese Veränderungen der Membraneigenschaften führten bei hyperosmotischem Stress im erg6Δ-Stamm, nicht aber im WT-Stamm, zum Bruch der Plasmamembran und zum Zelltod (Dupont et al. 2011). Die Beziehung zwischen der Art des vorherrschenden Sterins und den Membraneigenschaften basiert auf der Struktur des Sterinmoleküls, einschließlich seiner planaren Struktur, Größe und den Eigenschaften seiner kleinen polaren 3-OH-Gruppe (Xu und London 2000). Insbesondere die C-7,8-Doppelbindung des Sterol-B-Rings, die nur in den erg5Δ-, erg4Δ- und WT-Stämmen vorhanden ist (Abb. 1B), ist bekanntlich an der Packung und der Gesamtsteifigkeit der Plasmamembran beteiligt (Xu und London 2000; Bakht und London 2006). Somit könnte die Entwicklung der chemischen Struktur der Sterole im EBP sowohl die antioxidative und mechanisch stabilisierende Rolle dieser Moleküle in der Plasmamembran verbessern als auch den progressiven Anstieg der Resistenz der Hefestämme gegen Trocknung/Befeuchtung entlang des EBP erklären.
Unter klassischen Laborbedingungen hat die Art der Sterole keinen Einfluss auf das Hefewachstum. In der Tat wuchsen die WT- und ergΔ-Stämme mit der gleichen Kinetik auf Vollmedien (Daten nicht gezeigt). Die Anreicherung anderer Sterole (Cholesterin, Desmosterol oder Campesterol) durch Hefen, die durch genetische Transformation induziert wurde, hat keine Auswirkungen auf das Zellwachstum (Souza et al. 2011). Somit ist die Art der Sterole für Zellen unter Stressbedingungen entscheidend. Die Tatsache, dass die Abwärtsentwicklung des EBP die Resistenz der Hefe gegenüber Trocken- und Feuchtigkeitsereignissen erhöht, stellt eine mögliche Verbindung zwischen diesem Stoffwechselweg und der Fähigkeit der Pilze her, in Grenzflächenhabitaten zu überleben. Dieses Ergebnis hat wichtige Auswirkungen auf die Bloch-Hypothese, die auf der Beobachtung beruht, dass die Sterinwege parallel zur Sterinevolution verlaufen und dass das Produkt eines jeden Schritts die zellulären und physiologischen Funktionen besser unterstützen sollte als seine Vorläufer (Bloch 1983). Diese Hypothese, die hauptsächlich für die strukturelle Funktion von Sterolen getestet wurde, wurde jedoch nie durch experimentelle Fakten gestützt. So wurde beispielsweise für den Cholesterinweg gezeigt, dass einige Vorläuferstoffe für die Raft-Stabilisierung in einer Modellmembran effizienter sind als Cholesterin (Bakht und London 2006). Die Beteiligung von Ergosterol an der Resistenz von Hefen gegen Trocknungs- und Benetzungsereignisse könnte der Grund für die Entwicklung des EBP und das weit verbreitete Vorkommen von Ergosterol in Landpilzen sein (Weete et al. 2010). Die Entwicklung der chemischen Struktur der Sterole in der EBP könnte sowohl die antioxidative und mechanische Stabilisierungsfunktion dieser Moleküle in der Plasmamembran verbessert haben als auch die fortschreitende Zunahme der Resistenz von Hefestämmen gegen Trocknung/Nässe entlang der EBP erklären. Diese Studie, die in einem zellulären Kontext durchgeführt wurde, liefert die ersten experimentellen Daten, die die Bloch-Hypothese unterstützen.
Trotz der wichtigen Rolle, die Ergosterol für die Persistenz von Hefen in ihrer natürlichen Umgebung zu spielen scheint, haben Weete et al., die sich mit der Frage der Diversität von Sterolen in Pilzen beschäftigten, gezeigt, dass Ergosterol nicht das einzige Sterol in diesem Reich ist (Weete et al. 2010). Die Ergebnisse dieser Studie unterstützen die Idee, dass Cholesterin als das primitivste Sterol der Pilze angesehen werden kann und dass die Entwicklung der spezifischen Struktur von Ergosterin durch funktionelle Anforderungen angetrieben wurde, die für die sich entwickelnden Pilze spezifisch waren. Die primitiven Pilze, die Cholesterin akkumulieren, sind in der Tat gegeißelt und leben in einem aquatischen Medium (James et al. 2006; Weete et al. 2010), wo die Hydratation maximal und stabil ist. Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass Cholesterin ein effizienter mechanischer Stabilisator ist (Bakht und London 2006); obwohl es als Antioxidans weniger wirksam ist als Ergosterol (Wiseman 1993) (Cholesterin besitzt nur eine Doppelbindung im B-Ring), ist es in der Herstellung energetisch weniger aufwendig (Parks und Casey 1995). Diese Daten, zusammen mit den Ergebnissen der vorliegenden Studie, könnten bedeuten, dass die Synthese von Ergosterol einen wichtigen Vorteil für das Überleben höherer Pilze und die Besiedlung der Fest-Luft-Grenzflächen darstellt.
Wir kommen zu dem Schluss, dass das Überleben beim Trocknen und Befeuchten in der Hefe, einem einzelligen Eukaryoten, der nicht in der Lage ist, eine Wasserhomöostase aufrechtzuerhalten, durch Ergosterol erleichtert wird. Dieser essentielle Bestandteil, der spezifisch für die Membranen von Pilzen ist, erhöht die Widerstandsfähigkeit gegen mechanische Beanspruchung und Oxidation, die durch Wasserverdunstung und direkte Einwirkung von Luft verursacht wird. Daher könnte die Entwicklung des EBP ein Schlüsselelement bei der Eroberung von Lebensräumen an der Fest-Luft-Grenzfläche durch Pilze gewesen sein. Die Ergebnisse dieser Studie legen eine Antwort auf die immer wieder gestellte Frage nahe: „Warum Ergosterol in Pilzen?“ (Parks und Casey 1995). Die Mechanismen, die mit diesen Ergebnissen zusammenhängen, sollten in zukünftigen Experimenten vertieft werden. Zu diesem Zweck untersuchen wir derzeit die molekularen Eigenschaften von Ergosterol in der Plasmamembran, um die Mechanismen aufzuklären, durch die Ergosterol die Membran vor chemischen und physikalischen Veränderungen durch Lufttrocknung und Befeuchtung bewahrt. Zu den erwarteten Anwendungen gehören die Optimierung von Trocknungsmethoden für die Konservierung eukaryontischer Zellen und die Entwicklung neuer Strategien für die Zerstörung von Pilzen, die an zahlreichen pathogenen und lebensmittelverderbenden Aktivitäten beteiligt sind.