Diskussion

Resultaterne af denne undersøgelse viser for første gang, at ergosterolsyntesen spiller en central rolle for gærens modstandsdygtighed over for tørring/vådbehandlinger (fig. 2). Udskiftning af zymosterol, det tidligste sterol i EBP, der blev testet i denne undersøgelse (erg6Δ-stammen), med ergosterol tillod genoprettelse af resistens til det niveau, der blev observeret med WT-stammen (tabel 2). De vigtigste kemiske transformationer, der finder sted under biosynteseprocessen fra zymosterol til ergosterol, er en ændring i B-ringens og den alifatiske hales mætning (fig. 1B). Disse gradvise ændringer kan bidrage til optimering af molekylernes biofysiske egenskaber ved de efterfølgende trin i EBP-processen og kan forklare den øgede modstandsdygtighed over for tørre/befugtningscyklusser. Vores resultater viser, at de tre tidligst testede mutanter (erg6Δ, erg2Δ og erg3Δ) er meget følsomme over for tørring/befugtning. Det første brud i stigningen i modstandsdygtigheden langs EBP’en blev opdaget med erg5Δ-stammen. Denne steg gradvist med erg4Δ for at nå en maksimal værdi med WT-stammen (fig. 2). De kemiske strukturer af de vigtigste steroler, der akkumuleres af disse tre sidste stammer, er karakteriseret ved tilstedeværelsen af to dobbeltbindinger i B-ringen (Fig. 1B). Under et radikalt angreb gør disse konjugerede dobbeltbindinger det muligt at stabilisere sterolradikalerne ved hjælp af resonans (delokalisering af den uparrede elektron). Denne kemiske egenskab kunne forklare den gavnlige virkning på overlevelsen ved tørring/befugtning, som indebærer oxidation (Garre et al. 2010), ved at beskytte fosfolipiderne mod peroxidation på samme måde som E-vitamin (Packer 1991). De vigtigste steroler, der akkumuleres af de tre stammer med mutationer tidligt i EBP, har en unik dobbelt C-C-binding i C-7,8- eller C-8,9-positionen, langt fra hydroxylgruppen, hvilket ikke fremmer stabilisering af radikalen ved resonans. Dette kunne forklare den høje følsomhed af erg6Δ-, erg2Δ- og erg3Δ-stammerne over for tørring i atmosfærisk luft. Den gradvise stigning i modstanden mod enden af EBP (fig. 2), der er observeret hos erg5Δ-, erg4Δ- og WT-stammerne, kan være relateret til forskellen mellem sterolernes alifatiske haler (fig. 1B). Faktisk påvirker halestrukturen sterolernes planaritet, hvilket er afgørende for deres placering i membranen (Xu og London 2000; Bakht og London 2006). Således kan de sidste trin i ergosterolvejen muliggøre en bedre tilpasning af sterolerne i membranen ved at ændre parametre som f.eks. deres dybde i lipiddilaget for at optimere beskyttelsen af fosfolipiderne mod oxidation. Den sterolformidlede beskyttelse af lipider mod oxidation er allerede blevet påvist på modelmembraner (Wiseman 1993), men er aldrig blevet påvist på biologiske celler. Vores resultater viser for første gang en sammenhæng mellem sterolernes art og modstandsdygtigheden over for oxidation. De understøtter også en hypotese, der foreslog, at steroler kan have givet cellerne modstandsdygtighed over for oxidation, når iltniveauet steg under iltningen af jorden (Galea og Brown 2009; Brown og Galea 2010). Faktisk konkluderer forfatterne af denne undersøgelse, at syntesen af steroler, en ilt-afhængig proces (Fig. 1A), kunne have været et adaptivt svar på stigningen i jordens iltindhold.

Tørringseksperimenter udført under nitrogen førte til højere overlevelsesrater end lufttørringseksperimenter for alle testede stammer (Fig. 2). Effekten af iltmangel under tørring var stærk for stammerne med mutationer i tidlige komponenter af EBP, aftog for dem med mutationer i senere komponenter af EBP og var mindre for WT-stammen. Disse resultater viser, at oxidation spiller en vigtig rolle i den dødelige virkning af tørring under atmosfæriske forhold. Da dødsraten imidlertid fortsat var betydelig for erg6Δ, erg2Δ, erg3Δ og erg5Δ, når tørringen blev udført under nitrogen, konkluderer vi, at andre faktorer end oxidation bidrager til celledøden under tørring. En af disse faktorer kunne være alvorlige mekaniske begrænsninger på plasmamembranen som følge af vandtab fra cellerne ved osmotisk overførsel (Dupont et al. 2010). Sterolernes art er kendt for at påvirke plasmamembranens egenskaber som f.eks. fluiditet (Abe og Hiraki 2009) og typer af deformationer (Bacia et al. 2005; Dupont et al. 2011). Disse ændringer af membranegenskaberne førte til plasmamembranbrud og celledød under hyperosmotisk stress i erg6Δ-stammen, men ikke i WT-stammen (Dupont et al. 2011). Forholdet mellem arten af det fremherskende sterol og membranegenskaberne er baseret på sterolmolekylets struktur, herunder dets planare struktur, størrelse og egenskaberne af dets lille polære 3-OH-gruppe (Xu og London 2000). Især er C-7,8-dobbeltbindingen i sterol B-ringen, som kun er til stede i erg5Δ-, erg4Δ- og WT-stammerne (Fig. 1B), kendt for at være involveret i plasmamembranens pakning og generelle stivhed (Xu og London 2000; Bakht og London 2006). Udviklingen af sterolernes kemiske struktur i EBP kunne således både forbedre disse molekylers antioxidante og mekaniske stabiliserende rolle i plasmamembranen og forklare den progressive stigning langs EBP i gærstammernes modstandsdygtighed over for tørring/befugtning.

Under klassiske laboratoriebetingelser har sterolernes art ingen virkning på gærvækst. Faktisk voksede WT- og ergΔ-stammerne med den samme kinetik på fulde medier (data ikke vist). Akkumulation af andre steroler (kolesterol, desmosterol eller campesterol) af gær, induceret ved genetisk transformation, påvirker ikke cellevæksten (Souza et al. 2011). Sterolernes art er således afgørende for celler under stressbetingelser. Den kendsgerning, at progression nedad EBP øger gærresistens over for tørre/fugtige hændelser, etablerer en potentiel forbindelse mellem denne vej og svampenes evne til at overleve i grænseflademiljøer. Dette resultat har vigtige implikationer for Bloch-hypotesen, som er baseret på den iagttagelse, at sterolbanerne er parallelle med steroludviklingen, og at produktet af hvert trin bør understøtte cellulære og fysiologiske funktioner bedre end dets forløbere (Bloch 1983). Denne hypotese, som hovedsagelig er blevet testet for sterolernes strukturelle funktion, er imidlertid aldrig blevet understøttet af eksperimentelle fakta. For eksempel er det i kolesterolvejen blevet vist, at nogle forløbere er mere effektive end kolesterol til flådestabilisering i en modelmembran (Bakht og London 2006). Ergosterols involvering i gærresistens over for tørre/befugtningshændelser kunne ligge til grund for udviklingen af EBP og for den udbredte forekomst af ergosterol i landsvampe (Weete et al. 2010). Udviklingen af sterolernes kemiske struktur i EBP kunne nemlig både have forbedret disse molekylers antioxidante og mekaniske stabiliserende rolle i plasmamembranen og forklare den progressive stigning langs EBP i gærstammernes modstandsdygtighed over for tørring/befugtning. Denne undersøgelse, der er udført i en cellulær sammenhæng, giver de første eksperimentelle data, der understøtter Bloch-hypotesen.

På trods af den store rolle, som ergosterol synes at spille for gærers persistens i deres naturlige miljø, har Weete et al., der har behandlet spørgsmålet om sterolernes diversitet i svampe, vist, at ergosterol ikke er det eneste sterol i dette rige (Weete et al. 2010). Resultaterne af denne undersøgelse understøtter ideen om, at kolesterol kan betragtes som det mest primitive svampesterol, og at udviklingen af ergosterolets specifikke struktur blev drevet af funktionelle krav, der er specifikke for svampe under udvikling. Faktisk er de primitive svampe, der akkumulerer kolesterol, flagellerede og lever i et akvatisk medium (James et al. 2006; Weete et al. 2010), hvor hydrering er maksimal og stabil. Dette er i overensstemmelse med det faktum, at kolesterol er en effektiv mekanisk stabilisator (Bakht og London 2006); selv om det er mindre effektivt som antioxidant end ergosterol (Wiseman 1993) (kolesterol besidder kun én dobbeltbinding i B-ringen), er det mindre energimæssigt dyrt at producere (Parks og Casey 1995). Disse data, sammenholdt med resultaterne af den foreliggende undersøgelse, kunne betyde, at syntesen af ergosterol giver en vigtig fordel for højere svampes overlevelse og kolonisering af habitater i grænsefladerne mellem faste stoffer og luft.

Vi konkluderer, at ergosterol letter overlevelsen af tørring og vådhed i gær, en encellet eukaryot, der ikke er i stand til at opretholde vandhomeostase, ved hjælp af ergosterol. Denne essentielle komponent, der er specifik for svampemembranerne, øger modstandsdygtigheden over for mekaniske begrænsninger og oxidation forårsaget af vandfordampning og direkte eksponering for atmosfærisk luft. Derfor kan udviklingen af EBP have været et nøgleelement i svampenes erobring af habitater i grænsefladerne mellem fast luft og luft. Resultaterne af denne undersøgelse antyder et svar på det vedvarende spørgsmål “hvorfor ergosterol i svampe?”. (Parks og Casey 1995). De mekanismer, der er knyttet til disse resultater, bør uddybes i fremtidige eksperimenter. Med henblik herpå er vi i øjeblikket i gang med at undersøge ergosterols molekylære egenskaber i plasmamembranen for at belyse de mekanismer, hvormed ergosterol bevarer membranen mod kemiske og fysiske ændringer forårsaget af lufttørring og befugtning. De forventede anvendelser omfatter optimering af tørringsbaserede metoder til konservering af eukaryote celler og udvikling af nye strategier til destruktion af svampe, der er involveret i mange patogene og fødevarebeskadigende aktiviteter.