Discussão

Os resultados deste estudo demonstram pela primeira vez o papel fundamental da síntese do ergosterol na resistência das leveduras aos tratamentos de secagem/umidificação (Fig. 2). A substituição do zymosterol, o mais antigo esterol da EBP testado neste estudo (cepa erg6Δ), pelo ergosterol permitiu a restauração da resistência ao nível observado com a cepa WT (Tabela 2). As principais transformações químicas que ocorrem durante o processo biossintético do zymosterol para o ergosterol são uma alteração na saturação do anel B e da cauda alifática (Fig. 1B). Essas modificações graduais poderiam contribuir para a otimização das propriedades biofísicas das moléculas nas etapas seguintes ao longo da EBP e poderiam explicar o aumento da resistência aos ciclos de secagem/umidificação. Nossos resultados mostram que os três primeiros mutantes testados (erg6Δ, erg2Δ, e erg3Δ) são altamente sensíveis à secagem/molhamento. A primeira quebra no aumento da resistência ao longo da EBP foi detectada com a estirpe erg5Δ. Isto aumentou progressivamente com erg4Δ para atingir um valor máximo com a estirpe WT (Fig. 2). As estruturas químicas dos principais esteróis acumulados por estas três últimas estirpes são caracterizadas pela presença de duas ligações duplas no anel B (Fig. 1B). Durante um ataque radical, estas ligações duplas conjugadas permitem a estabilização dos radicais esteróis por ressonância (deslocalização do elétron não emparelhado). Esta característica química poderia explicar o efeito benéfico na sobrevivência à secagem/umidificação, que envolve oxidação (Garre et al. 2010), ao proteger os fosfolípidos contra a peroxidação da mesma forma que a vitamina E (Packer 1991). Os principais esteróis acumulados pelas três estirpes com mutações no início da EBP possuem uma dupla ligação C-C única na posição C-7,8 ou C-8,9, longe do grupo hidroxila, o que não promove a estabilização do radical por ressonância. Isto poderia explicar a alta sensibilidade das estirpes erg6Δ, erg2Δ, e erg3Δ à secagem sob o ar atmosférico. O aumento progressivo da resistência ao final da EBP (Fig. 2), observado com as cepas erg5Δ, erg4Δ e WT, pode estar relacionado à diferença entre as caudas alifáticas dos esteróis (Fig. 1B). De facto, a estrutura da cauda afecta a planaridade dos esteróis, o que é um determinante da sua posição na membrana (Xu e Londres 2000; Bakht e Londres 2006). Assim, as etapas finais do percurso do ergosterol podem permitir um melhor encaixe do esterol na membrana, modificando parâmetros como a sua profundidade no bocal lipídico, para otimizar a proteção dos fosfolipídios contra a oxidação. A proteção mediada por esterol dos lipídios contra a oxidação já foi demonstrada em membranas modelo (Wiseman 1993), mas nunca foi demonstrada em células biológicas. Os nossos resultados mostram, pela primeira vez, uma relação entre a natureza dos esteróis e a resistência à oxidação. Eles também apoiam uma hipótese que propôs que os esteróis podem ter dado às células resistência à oxidação quando os níveis de oxigênio subiram durante a oxigenação da Terra (Galea e Brown 2009; Brown e Galea 2010). De fato, os autores deste estudo concluem que a síntese de esteróis, um processo dependente de oxigênio (Fig. 1A), poderia ter sido uma resposta adaptativa ao aumento do oxigênio terrestre.

Experimentos de secagem realizados sob nitrogênio levaram a maiores taxas de sobrevivência do que os experimentos de secagem ao ar para todas as linhagens testadas (Fig. 2). O efeito da ausência de oxigênio durante a secagem foi forte para as cepas com mutações em componentes iniciais da EBP, diminuiu para aquelas com mutações em componentes posteriores da EBP, e foi menor para a cepa WT. Estes resultados mostram que a oxidação tem um papel importante no efeito letal da secagem sob condições atmosféricas. No entanto, como a taxa de mortalidade permaneceu substancial para erg6Δ, erg2Δ, erg3Δ, e erg5Δ quando a secagem foi realizada sob nitrogênio, concluímos que outros fatores além da oxidação contribuem para a morte da célula durante a secagem. Um desses fatores pode ser severas restrições mecânicas na membrana plasmática resultantes da perda de água das células por transferência osmótica (Dupont et al. 2010). Na verdade, a natureza dos esteróis é conhecida por influenciar as propriedades da membrana plasmática, tais como fluidez (Abe e Hiraki 2009) e tipos de deformação (Bacia et al. 2005; Dupont et al. 2011). Essas modificações das propriedades da membrana levaram à ruptura da membrana plasmática e à morte celular durante o estresse hiperosmótico na cepa erg6Δ, mas não no WT (Dupont et al. 2011). A relação entre a natureza do esterol predominante e as propriedades da membrana é baseada na estrutura da molécula de esterol, incluindo sua estrutura planar, tamanho e propriedades de seu pequeno grupo polar 3-OH (Xu e Londres 2000). Em particular, a dupla ligação C-7,8 do anel B de esterol, presente apenas nas estirpes erg5Δ, erg4Δ e WT (Fig. 1B), é conhecida por estar envolvida na embalagem e na rigidez geral da membrana plasmática (Xu e Londres 2000; Bakht e Londres 2006). Assim, a evolução da estrutura química dos esteróis na EBP poderia melhorar o papel antioxidante e estabilizador mecânico dessas moléculas na membrana plasmática e explicar o aumento progressivo ao longo da EBP da resistência das estirpes de levedura à secagem/umidificação.

Em condições laboratoriais clássicas, a natureza dos esteróis não tem qualquer efeito no crescimento da levedura. De facto, as estirpes WT e ergΔ cresceram com a mesma cinética em meios completos (dados não mostrados). A acumulação de outros esteróis (colesterol, desmosterol ou campesterol) por leveduras, induzidas por transformação genética, não afeta o crescimento celular (Souza et al. 2011). Assim, a natureza dos esteróis é crucial para as células sob condições de estresse. O fato de que a progressão para baixo do EBP aumenta a resistência da levedura a eventos de secagem/humidade estabelece uma ligação potencial entre este caminho e a capacidade de sobrevivência dos fungos em habitats interfaciais. Este resultado tem implicações importantes para a hipótese de Bloch, que se baseia na observação de que as vias do esterol evoluem paralelamente e que o produto de cada etapa deve suportar melhor as funções celulares e fisiológicas do que os seus precursores (Bloch 1983). No entanto, esta hipótese, que tem sido testada principalmente para a função estrutural dos esteróis, nunca foi suportada por fatos experimentais. Por exemplo, na via do colesterol, foi demonstrado que alguns precursores são mais eficientes do que o colesterol para estabilização da jangada em uma membrana modelo (Bakht e Londres 2006). O envolvimento do ergosterol na resistência da levedura a eventos de secagem/humidade pode estar na origem da evolução do EBP e da presença generalizada do ergosterol em fungos terrestres (Weete et al. 2010). De facto, a evolução da estrutura química dos esteróis na EBP poderia ter melhorado o papel antioxidante e estabilizador mecânico destas moléculas na membrana plasmática e explicar o aumento progressivo ao longo da EBP da resistência das estirpes de levedura à secagem/humidificação. Este estudo, realizado em um contexto celular, fornece os primeiros dados experimentais que suportam a hipótese de Bloch.

Apesar do papel importante que o ergosterol parece desempenhar na persistência de leveduras em seu ambiente natural, Weete et al., que abordaram a questão da diversidade de esteróis em fungos, mostraram que o ergosterol não é o único esterol neste reino (Weete et al. 2010). Os resultados deste estudo apoiam a ideia de que o colesterol pode ser considerado o esterol fúngico mais primitivo e que a evolução da estrutura específica do ergosterol foi impulsionada por requisitos funcionais específicos dos fungos em evolução. De fato, os fungos primitivos que acumulam o colesterol são flagelados e vivem em um meio aquático (James et al. 2006; Weete et al. 2010) onde a hidratação é máxima e estável. Isto é consistente com o facto do colesterol ser um estabilizador mecânico eficiente (Bakht e Londres 2006); embora seja menos eficaz como antioxidante do que o ergosterol (Wiseman 1993) (o colesterol possui apenas uma dupla ligação no anel B), a sua produção é menos cara do ponto de vista energético (Parks e Casey 1995). Estes dados, reunidos com os resultados do presente estudo, podem significar que a síntese do ergosterol confere uma importante vantagem para uma maior sobrevivência dos fungos e para a colonização dos habitats interfaciais do ar sólido.

Concluímos que a sobrevivência da secagem e molhagem é facilitada em leveduras, um eucariote unicelular incapaz de manter a homeostase da água, pelo ergosterol. Este componente essencial, específico para as membranas dos fungos, aumenta a resistência às restrições mecânicas e à oxidação causada pela evaporação da água e pela exposição directa ao ar atmosférico. Portanto, a evolução da EBP pode ter sido um elemento chave na conquista de habitats interfaciais de ar sólido por fungos. Os resultados deste estudo sugerem uma resposta à pergunta permanente “porquê o ergosterol em fungos? (Parks and Casey 1995). Os mecanismos relacionados com estes resultados devem ser aprofundados em experiências futuras. Para este propósito, estamos atualmente estudando as propriedades moleculares do ergosterol na membrana plasmática para elucidar os mecanismos pelos quais o ergosterol preserva a membrana de alterações químicas e físicas causadas pela secagem e umectação do ar. As aplicações esperadas incluem a otimização de métodos baseados em secagem para preservação de células eucarióticas e o desenvolvimento de novas estratégias para a destruição de fungos envolvidos em muitas atividades patogênicas e deterioração de alimentos.