Keskustelu

Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat ensimmäistä kertaa ergosterolin synteesin keskeisen roolin hiivojen vastustuskyvyssä kuivaus-/kostutuskäsittelyjä vastaan (kuva 2). Tässä tutkimuksessa testatun EBP:n (erg6Δ-kanta) varhaisimman sterolin, zymosterolin, korvaaminen ergosterolilla mahdollisti resistenssin palauttamisen WT-kannalla havaitulle tasolle (taulukko 2). Tärkeimmät kemialliset muunnokset, jotka tapahtuvat biosynteettisen prosessin aikana zymosterolista ergosteroliksi, ovat B-renkaan ja alifaattisen hännän kylläisyyden muutos (kuva 1B). Nämä asteittaiset muutokset voivat edistää molekyylien biofysikaalisten ominaisuuksien optimointia EBP:n myöhemmissä vaiheissa ja selittää kuivaus-/kostutussyklien kestävyyden lisääntymisen. Tuloksemme osoittavat, että kolme varhaisinta testattua mutanttia (erg6Δ, erg2Δ ja erg3Δ) ovat erittäin herkkiä kuivaukselle/kostutukselle. Ensimmäinen katkos resistenssin lisääntymisessä EBP:tä pitkin havaittiin erg5Δ-kannassa. Tämä kasvoi asteittain erg4Δ:n kanssa saavuttaen maksimiarvon WT-kannalla (kuva 2). Näiden kolmen viimeksi mainitun kannan keräämien päästerolien kemiallisille rakenteille on ominaista, että B-renkaassa on kaksi kaksoissidosta (kuva 1B). Radikaalihyökkäyksen aikana nämä konjugoidut kaksoissidokset mahdollistavat steroliradikaalien stabiloinnin resonanssin avulla (parittoman elektronin delokalisaatio). Tämä kemiallinen ominaisuus voisi selittää sen suotuisan vaikutuksen eloonjäämiseen kuivauksesta/kostutuksesta, johon liittyy hapettumista (Garre ym. 2010), suojaamalla fosfolipidejä peroksidoitumiselta samaan tapaan kuin E-vitamiinia (Packer 1991). Tärkeimmillä steroleilla, joita kertyi kolmessa kannassa, joissa oli EBP:n varhaisessa vaiheessa olevia mutaatioita, on ainutlaatuinen C-C-kaksoissidos C-7,8- tai C-8,9-asemassa kaukana hydroksyyliryhmästä, mikä ei edistä radikaalin stabiloitumista resonanssilla. Tämä voisi selittää erg6Δ-, erg2Δ- ja erg3Δ-kantojen suuren herkkyyden kuivumiselle ilmakehän ilmassa. Erg5Δ-, erg4Δ- ja WT-kannoilla havaittu resistenssin asteittainen lisääntyminen EBP:n loppua kohti (kuva 2) saattaa liittyä sterolien alifaattisten häntien väliseen eroon (kuva 1B). Häntärakenne vaikuttaa nimittäin sterolien tasomaisuuteen, joka määrää niiden sijainnin kalvossa (Xu ja London 2000; Bakht ja London 2006). Näin ollen ergosterolireitin viimeiset vaiheet saattavat mahdollistaa sterolin paremman sovittamisen kalvoon ja muuttaa parametreja, kuten niiden syvyyttä lipidikaksoiskerroksessa, jotta fosfolipidien suojaus hapettumiselta voidaan optimoida. Sterolivälitteinen lipidien suojaaminen hapettumiselta on jo osoitettu mallikalvoilla (Wiseman 1993), mutta sitä ei ole koskaan osoitettu biologisissa soluissa. Tuloksemme osoittavat ensimmäistä kertaa, että sterolien luonteen ja hapettumiskestävyyden välillä on yhteys. Ne myös tukevat hypoteesia, jossa ehdotettiin, että sterolit ovat saattaneet antaa soluille vastustuskykyä hapettumista vastaan, kun happipitoisuudet nousivat maan hapetuksen aikana (Galea ja Brown 2009; Brown ja Galea 2010). Tämän tutkimuksen tekijät päättelevätkin, että sterolien synteesi, joka on hapesta riippuvainen prosessi (kuva 1A), on voinut olla sopeutumisreaktio maapallon happipitoisuuden nousuun.

Kuivauskokeet, jotka suoritettiin typen alla, johtivat korkeampiin eloonjäämislukuihin kuin ilmakuivauskokeet kaikkien testattujen kantojen osalta (kuva 2). Hapettomuuden vaikutus kuivauksen aikana oli voimakas kannoille, joissa oli mutaatioita EBP:n varhaisissa komponenteissa, väheni kannoille, joissa oli mutaatioita EBP:n myöhemmissä komponenteissa, ja oli vähäinen WT-kannalle. Nämä tulokset osoittavat, että hapettumisella on suuri merkitys ilmakehäolosuhteissa tapahtuvan kuivauksen tappavaan vaikutukseen. Koska kuoleman määrä pysyi kuitenkin huomattavana erg6Δ:n, erg2Δ:n, erg3Δ:n ja erg5Δ:n osalta, kun kuivaus suoritettiin typen alla, voimme päätellä, että muut tekijät kuin hapettuminen vaikuttavat solukuolemaan kuivauksen aikana. Yksi näistä tekijöistä voisi olla plasmakalvoon kohdistuvat vakavat mekaaniset rajoitteet, jotka johtuvat solujen vesihäviöstä osmoottisen siirtymisen kautta (Dupont ym. 2010). Sterolien luonteen tiedetäänkin vaikuttavan plasmakalvon ominaisuuksiin, kuten juoksevuuteen (Abe ja Hiraki 2009) ja muodonmuutostyyppeihin (Bacia ym. 2005; Dupont ym. 2011). Nämä kalvo-ominaisuuksien muutokset johtivat plasmakalvon repeämiseen ja solukuolemaan hyperosmoottisen stressin aikana erg6Δ-kannassa mutta ei WT-kannassa (Dupont ym. 2011). Vallitsevan sterolin luonteen ja kalvon ominaisuuksien välinen suhde perustuu sterolimolekyylin rakenteeseen, mukaan lukien sen tasorakenne, koko ja sen pienen polaarisen 3-OH-ryhmän ominaisuudet (Xu ja London 2000). Erityisesti sterolin B-renkaan C-7,8-kaksoissidoksen, jota esiintyy vain erg5Δ-, erg4Δ- ja WT-kannoissa (kuva 1B), tiedetään vaikuttavan plasmakalvon pakkautumiseen ja yleiseen jäykkyyteen (Xu ja London 2000; Bakht ja London 2006). Näin ollen sterolien kemiallisen rakenteen kehittyminen EBP:ssä voisi sekä parantaa näiden molekyylien antioksidanttista ja mekaanista stabiloivaa roolia plasmamembraanissa että selittää hiivakantojen kuivaus-/kostutuskestävyyden asteittaisen lisääntymisen EBP:tä pitkin.

Klassisissa laboratorio-olosuhteissa sterolien luonteella ei ole vaikutusta hiivan kasvuun. Itse asiassa WT- ja ergΔ-kannat kasvoivat samalla kinetiikalla täydellä väliaineella (tietoja ei ole esitetty). Muiden sterolien (kolesteroli, desmosteroli tai kampesteroli) kertyminen hiivoihin geneettisellä transformaatiolla indusoituna ei vaikuta solujen kasvuun (Souza ym. 2011). Näin ollen sterolien luonne on ratkaisevan tärkeä soluille stressiolosuhteissa. Se, että EBP:n alaspäin eteneminen lisää hiivan vastustuskykyä kuivumis-/kostumistapahtumia vastaan, luo mahdollisen yhteyden tämän reitin ja sienten kyvyn selviytyä rajapintaympäristöissä. Tällä tuloksella on merkittäviä vaikutuksia Blochin hypoteesiin, joka perustuu havaintoon, että sterolireitit ovat samansuuntaisia sterolien evoluution kanssa ja että kunkin vaiheen tuotteen pitäisi tukea paremmin solujen ja fysiologisia toimintoja kuin sen esiasteet (Bloch 1983). Tätä hypoteesia, jota on testattu lähinnä sterolien rakenteellisen toiminnan osalta, ei kuitenkaan ole koskaan tuettu kokeellisilla tosiasioilla. Esimerkiksi kolesterolireitillä on osoitettu, että jotkin esiasteet ovat kolesterolia tehokkaampia lauttojen vakauttamisessa mallikalvossa (Bakht ja London 2006). Ergosterolin osallistuminen hiivan vastustuskykyyn kuivumis-/kostumistapahtumia vastaan voisi olla syynä EBP:n evoluutioon ja ergosterolin laajaan esiintymiseen maasienissä (Weete ym. 2010). Sterolien kemiallisen rakenteen kehittyminen EBP:ssä on voinut sekä parantaa näiden molekyylien antioksidanttista ja mekaanista stabiloivaa roolia plasmakalvossa että selittää hiivakantojen kuivumis-/kostumisresistenssin asteittaisen lisääntymisen EBP:tä pitkin. Tämä solukontekstissa tehty tutkimus tarjoaa ensimmäiset Blochin hypoteesia tukevat kokeelliset tiedot.

Huolimatta siitä merkittävästä roolista, joka ergosterolilla näyttää olevan hiivojen pysyvyydessä niiden luonnollisessa ympäristössä, Weete et al. jotka käsittelivät kysymystä sterolien monimuotoisuudesta sienissä, osoittivat, että ergosteroli ei ole ainoa steroli tässä valtakunnassa (Weete et al. 2010). Tämän tutkimuksen tulokset tukevat ajatusta, että kolesterolia voidaan pitää sienien alkeellisimpana sterolina ja että ergosterolin erityisen rakenteen evoluution taustalla ovat kehittyville sienille ominaiset toiminnalliset vaatimukset. Alkukantaiset sienet, jotka keräävät kolesterolia, ovat nimittäin flagelloituneita ja elävät vesiympäristössä (James ym. 2006; Weete ym. 2010), jossa hydratoituminen on maksimaalista ja vakaata. Tämä on sopusoinnussa sen kanssa, että kolesteroli on tehokas mekaaninen stabilointiaine (Bakht ja London 2006); vaikka se on antioksidanttina tehottomampi kuin ergosteroli (Wiseman 1993) (kolesterolilla on vain yksi kaksoissidos B-renkaassa), sen tuottaminen on energeettisesti halvempaa (Parks ja Casey 1995). Nämä tiedot yhdessä tämän tutkimuksen tulosten kanssa voivat merkitä sitä, että ergosterolin synteesi antaa merkittävän edun korkeampien sienten selviytymiselle ja kolonisaatiolle kiinteän ja ilman rajapinnan elinympäristöissä.

Johtopäätöksenä toteamme, että ergosteroli helpottaa hiivassa, joka on yksisoluinen eukaryootti, joka ei kykene ylläpitämään veden homeostaasia, selviytymistä kuivumisesta ja kostumisesta. Tämä olennainen komponentti, joka on spesifinen sienien kalvoille, lisää vastustuskykyä mekaanisia rajoitteita ja hapettumista vastaan, jotka aiheutuvat veden haihtumisesta ja suorasta altistumisesta ilmakehän ilmalle. Näin ollen EBP:n evoluutio on saattanut olla avainasemassa, kun sienet ovat valloittaneet kiinteän ja ilman rajapinnan elinympäristöjä. Tämän tutkimuksen tulokset antavat vastauksen pysyvään kysymykseen ”miksi ergosterolia sienissä?”. (Parks ja Casey 1995). Näihin tuloksiin liittyviä mekanismeja olisi syvennettävä tulevissa kokeissa. Tätä varten tutkimme parhaillaan ergosterolin molekyyliominaisuuksia plasmakalvossa selvittääksemme mekanismeja, joilla ergosteroli säilyttää kalvon ilmakuivatuksen ja kostutuksen aiheuttamilta kemiallisilta ja fysikaalisilta muutoksilta. Odotettavissa olevia sovelluksia ovat muun muassa eukaryoottisolujen säilyttämiseen käytettävien kuivaukseen perustuvien menetelmien optimointi ja uusien strategioiden kehittäminen moniin patogeenisiin ja elintarvikkeita pilaaviin toimintoihin osallistuvien sienten tuhoamiseksi.