Dyskusja
Wyniki tego badania po raz pierwszy wykazują kluczową rolę syntezy ergosterolu w odporności drożdży na zabiegi suszenia/mokrzenia (Rys. 2). Zastąpienie zymosterolu, najwcześniejszego sterolu EBP, który był badany w tej pracy (szczep erg6Δ), przez ergosterol pozwoliło na przywrócenie odporności do poziomu obserwowanego u szczepu WT (Tab. 2). Główne przemiany chemiczne zachodzące w procesie biosyntezy z zymosterolu do ergosterolu to zmiana wysycenia pierścienia B i ogona alifatycznego (Rys. 1B). Te stopniowe modyfikacje mog± przyczynić się do optymalizacji biofizycznych wła¶ciwo¶ci cz±steczek na kolejnych etapach EBP i wyja¶nić wzrost odporno¶ci na cykle suszenia i moczenia. Nasze wyniki pokazują, że trzy najwcześniej badane mutanty (erg6Δ, erg2Δ i erg3Δ) są bardzo wrażliwe na suszenie/mokro. Pierwsze załamanie wzrostu odporności wzdłuż EBP zostało wykryte u szczepu erg5Δ. Stopniowo wzrastała ona wraz z erg4Δ, by osiągnąć maksymalną wartość w przypadku szczepu WT (Rys. 2). Struktury chemiczne głównych steroli akumulowanych przez te trzy ostatnie szczepy charakteryzują się obecnością dwóch wiązań podwójnych w pierścieniu B (Rys. 1B). Podczas ataku rodnikowego, te sprzężone wiązania podwójne umożliwiają stabilizację rodników sterolowych poprzez rezonans (delokalizacja niesparowanego elektronu). Ta właściwość chemiczna może tłumaczyć korzystny wpływ na przeżywalność na suszenie/mokro, co wiąże się z utlenianiem (Garre et al. 2010), poprzez ochronę fosfolipidów przed peroksydacją w taki sam sposób jak witamina E (Packer 1991). Główne sterole akumulowane przez trzy szczepy z mutacjami na wczesnym etapie EBP posiadają unikalne podwójne wiązanie C-C w pozycji C-7,8 lub C-8,9, daleko od grupy hydroksylowej, co nie sprzyja stabilizacji rodnika przez rezonans. Może to tłumaczyć wysoką wrażliwość szczepów erg6Δ, erg2Δ i erg3Δ na suszenie w powietrzu atmosferycznym. Stopniowy wzrost oporności w kierunku końca EBP (Rys. 2), obserwowany u szczepów erg5Δ, erg4Δ i WT, może być związany z różnicą między ogonami alifatycznymi steroli (Rys. 1B). Istotnie, struktura ogona wpływa na planarność steroli, co jest wyznacznikiem ich pozycji w błonie (Xu i London 2000; Bakht i London 2006). Tak więc, końcowe etapy szlaku ergosterolowego mogą pozwolić na lepsze dopasowanie steroli w błonie, modyfikując takie parametry jak ich głębokość w obrębie dwuwarstwy lipidowej, aby zoptymalizować ochronę fosfolipidów przed utlenianiem. Sterolowa ochrona lipidów przed utlenianiem została już wykazana na modelowych membranach (Wiseman 1993), ale nigdy nie została zademonstrowana na komórkach biologicznych. Nasze wyniki pokazują, po raz pierwszy, związek pomiędzy naturą steroli a odpornością na utlenianie. Wspierają one również hipotezę, która proponowała, że sterole mogły zapewnić komórkom odporność na utlenianie, gdy poziom tlenu wzrósł podczas natleniania Ziemi (Galea i Brown 2009; Brown i Galea 2010). Rzeczywiście, autorzy tego badania stwierdzają, że synteza steroli, proces zależny od tlenu (ryc. 1A), mogła być adaptacyjną odpowiedzią na wzrost tlenu na Ziemi.
Doświadczenia z suszeniem przeprowadzone pod azotem prowadziły do wyższych wskaźników przeżywalności niż doświadczenia z suszeniem na powietrzu dla wszystkich badanych szczepów (Ryc. 2). Efekt braku tlenu podczas suszenia był silny dla szczepów z mutacjami we wczesnych komponentach EBP, zmniejszał się dla tych z mutacjami w późniejszych komponentach EBP i był niewielki dla szczepu WT. Wyniki te wskazują, że utlenianie odgrywa główną rolę w śmiertelnym efekcie suszenia w warunkach atmosferycznych. Jednakże, ponieważ śmiertelność pozostała znaczna dla erg6Δ, erg2Δ, erg3Δ i erg5Δ, gdy suszenie przeprowadzono w azocie, wnioskujemy, że czynniki inne niż utlenianie przyczyniają się do śmierci komórek podczas suszenia. Jednym z tych czynników mogą być poważne ograniczenia mechaniczne na błonie plazmatycznej wynikające z utraty wody z komórek przez transfer osmotyczny (Dupont et al. 2010). Rzeczywiście, wiadomo, że natura steroli wpływa na właściwości błony plazmatycznej, takie jak płynność (Abe i Hiraki 2009) i rodzaje deformacji (Bacia i wsp. 2005; Dupont i wsp. 2011). Te modyfikacje właściwości błony prowadziły do pęknięcia błony plazmatycznej i śmierci komórki podczas stresu hiperosmotycznego u szczepu erg6Δ, ale nie u WT (Dupont i wsp. 2011). Związek pomiędzy charakterem dominującego sterolu a właściwościami błonowymi opiera się na strukturze cząsteczki sterolu, w tym jej planarnej budowie, wielkości i właściwościach małej polarnej grupy 3-OH (Xu i London 2000). W szczególności, podwójne wiązanie C-7,8 pierścienia B sterolu, obecne tylko w szczepach erg5Δ, erg4Δ i WT (Rys. 1B), jest znane jako zaangażowane w upakowanie i ogólną sztywność błony plazmatycznej (Xu i London 2000; Bakht i London 2006). Tak więc, ewolucja struktury chemicznej steroli w EBP może zarówno poprawić antyoksydacyjną i mechaniczną rolę stabilizatora tych cząsteczek w błonie plazmatycznej, jak i wyjaśnić stopniowy wzrost wzdłuż EBP odporności szczepów drożdży na suszenie/mokro.
W klasycznych warunkach laboratoryjnych, natura steroli nie ma wpływu na wzrost drożdży. Rzeczywiście, szczepy WT i ergΔ rosły z taką samą kinetyką na pełnym podłożu (dane nie pokazane). Akumulacja innych steroli (cholesterolu, desmosterolu lub kampesterolu) przez drożdże, indukowana transformacją genetyczną, nie wpływa na wzrost komórek (Souza et al. 2011). Tak więc, charakter steroli jest kluczowy dla komórek w warunkach stresu. Fakt, że progresja w dół EBP zwiększa odporność drożdży na suszenie/moknięcie, wskazuje na potencjalny związek między tą ścieżką a zdolnością grzybów do przetrwania w siedliskach międzyfazowych. Wynik ten ma ważne implikacje dla hipotezy Blocha, która opiera się na obserwacji, że szlaki sterolowe są równoległe do ewolucji steroli i że produkt każdego etapu powinien lepiej wspierać funkcje komórkowe i fizjologiczne niż jego prekursory (Bloch 1983). Jednak ta hipoteza, która była testowana głównie pod kątem strukturalnej funkcji steroli, nigdy nie została poparta faktami eksperymentalnymi. Na przykład, w szlaku cholesterolowym wykazano, że niektóre prekursory są bardziej wydajne niż cholesterol w stabilizacji tratw w modelowej błonie (Bakht i London 2006). Zaangażowanie ergosterolu w odporność drożdży na wysychanie/moknięcie może leżeć u podstaw ewolucji EBP i powszechnej obecności ergosterolu u grzybów lądowych (Weete et al. 2010). Rzeczywiście, ewolucja struktury chemicznej steroli w EBP mogła zarówno poprawić antyoksydacyjne i mechaniczne stabilizatory tych cząsteczek w błonie plazmatycznej, jak i wyjaśnić stopniowy wzrost wzdłuż EBP odporności szczepów drożdży na wysychanie/moknięcie. Badanie to, przeprowadzone w kontekście komórkowym, dostarcza pierwszych danych eksperymentalnych wspierających hipotezę Blocha.
Pomimo głównej roli, jaką ergosterol wydaje się odgrywać w utrzymywaniu się drożdży w ich naturalnym środowisku, Weete i wsp., którzy zajęli się kwestią różnorodności steroli w grzybach, wykazali, że ergosterol nie jest jedynym sterolem w tym królestwie (Weete i wsp. 2010). Wyniki tych badań potwierdzają tezę, że cholesterol może być uważany za najbardziej prymitywny sterol grzybów, a ewolucja specyficznej struktury ergosterolu była napędzana przez wymagania funkcjonalne specyficzne dla ewoluujących grzybów. Rzeczywiście, prymitywne grzyby, które gromadzą cholesterol, są flagellowane i żyją w środowisku wodnym (James et al. 2006; Weete et al. 2010), gdzie uwodnienie jest maksymalne i stabilne. Jest to zgodne z faktem, że cholesterol jest skutecznym stabilizatorem mechanicznym (Bakht i London 2006); chociaż jest mniej skuteczny jako antyoksydant niż ergosterol (Wiseman 1993) (cholesterol posiada tylko jedno wiązanie podwójne w pierścieniu B), to jego produkcja jest mniej kosztowna energetycznie (Parks i Casey 1995). Dane te, w połączeniu z wynikami niniejszych badań, mogą oznaczać, że synteza ergosterolu stanowi istotną zaletę dla przetrwania grzybów wyższych i kolonizacji siedlisk międzyfazowych ciało stałe-powietrze.
Wyciągamy wniosek, że przetrwanie suszenia i moczenia jest ułatwione w drożdżach, jednokomórkowym eukarioncie niezdolnym do utrzymania homeostazy wody, przez ergosterol. Ten istotny składnik, specyficzny dla błon grzybów, zwiększa odporność na ograniczenia mechaniczne i utlenianie spowodowane parowaniem wody i bezpośrednią ekspozycją na powietrze atmosferyczne. Dlatego też ewolucja EBP mogła być kluczowym elementem w podboju przez grzyby siedlisk międzyfazowych ciało stałe-powietrze. Wyniki tych badań sugerują odpowiedź na odwieczne pytanie „dlaczego ergosterol u grzybów?” (Parks i Casey 1995). Mechanizmy zwi±zane z tymi odkryciami powinny być pogłębione w przyszłych eksperymentach. W tym celu badamy obecnie molekularne wła¶ciwo¶ci ergosterolu w błonie plazmatycznej, aby wyja¶nić mechanizmy, dzięki którym ergosterol chroni błonę przed chemicznymi i fizycznymi zmianami spowodowanymi suszeniem i zwilżaniem powietrzem. Oczekiwane zastosowania obejmują optymalizację opartych na suszeniu metod konserwacji komórek eukariotycznych oraz rozwój nowych strategii niszczenia grzybów zaangażowanych w wiele patogennych i psujących żywność działań.