Abstract

L’étude actuelle présente la quantification simultanée du dexpanthénol et du résorcinol à partir de formulation de soins capillaires commercialisés. Le dexpanthénol est souvent présent en tant qu’ingrédient actif dans les produits de soins personnels pour ses propriétés embellissantes et tonifiantes et ses propriétés réparatrices et lissantes. D’autre part, le résorcinol est principalement prescrit pour le traitement de la dermatite séborrhéique du cuir chevelu. Les effets secondaires toxiques du résorcinol limitent son utilisation dans les préparations dermatologiques. Par conséquent, une technique de quantification précise pour l’estimation simultanée de ces deux composants peut être utile aux industries de formulation pour l’analyse précise de la qualité de leurs produits. Dans la présente étude, une technique de chromatographie liquide à haute performance a été développée en utilisant une colonne C18 et une phase mobile constituée d’un tampon phosphate de pH = 2,8 suivant une élution en gradient. Le débit de la phase mobile était de 0,6 ml par minute et la longueur d’onde de détection était de 210 nm pour le dexpanthénol et de 280 nm pour le résorcinol. L’étude de linéarité a été réalisée à partir de cinq solutions ayant des concentrations comprises entre 10,34 μg-mL-1 et 82,69 μg-mL-1 () pour le résorcinol et 10,44 μg-mL-1 et 83,50 μg-mL-1 () pour le dexpanthénol. La méthode a été validée conformément aux directives ICH Q2(R1). La facilité de préparation des échantillons en une seule étape, l’étude de l’exactitude et de la précision (intrajournalière et interjournalière) présente la méthode adaptée à la quantification simultanée du dexpanthénol et du résorcinol à partir de tout produit de soins personnels et de préparations dermatologiques contenant ces deux ingrédients.

1. Introduction

Le dexpanthénol (DP) est l’analogue alcoolique de l’acide D-pantothénique. Chimiquement, il s’agit du 2,4-dihydroxy-N-(3-hydroxypropyl)-3,3-diméthyl-1-butanamide communément présent en tant qu’ingrédient actif dans un certain nombre de suppléments du complexe vitaminique B et de cosmétiques (crèmes, pommades, lotions, etc.) pour ses propriétés embellissantes et tonifiantes et ses propriétés réparatrices et lissantes . La DP est absorbée par la peau et se transforme en sa forme active, l’acide pantothénique (vitamine B5), précurseur de la biosynthèse du coenzyme A. La forme acide joue un rôle important dans le cycle de Krebs . L’acide pantothénique est également considéré comme une « vitamine anti-stress » car sa carence peut entraîner différents types de maladies telles que l’irritation de la peau, la dermatite, la dépigmentation des cheveux et le retard de croissance. Dans les préparations dermatologiques, elle est généralement administrée à raison de 2 à 5 %. En raison de ses propriétés réparatrices, lissantes et antidermatites et de dépigmentation, il est souvent utilisé dans les produits de soins capillaires et certaines formulations vitaminées.

Le candidat suivant sous notre étude est le résorcinol (RC) ou benzène-1,3-diol. Il a obtenu un certain nombre d’applications pharmaceutiques comme le traitement de l’acaïne, de la dermatite séborrhéique, de l’eczéma, du psoriasis et d’autres troubles cutanés. Elle est également utilisée dans les agents de coloration des cheveux. Cependant, cette molécule a un certain nombre d’effets secondaires lors d’une utilisation à long terme ou à forte dose. La recherche montre qu’une utilisation à long terme de la CR entraîne des effets réversibles sur la glande thyroïde humaine, ce qui entraîne une hypothyroïdie. Par conséquent, une méthode exacte pour la quantification du RC à partir de formulations prescrites pour un usage médicinal et cosmétique est essentielle.

Plusieurs préparations cosmétiques et pharmaceutiques contiennent à la fois du RC et du DP, soit sous forme d’excipients, soit comme composants actifs, et très peu de méthodes ont été rapportées pour leur quantification à partir de ces formulations. Là encore, la plupart des techniques rapportées présentent des méthodes pour soit le RC, soit le DP. La plupart des méthodes décrites pour la quantification du RC sont des techniques spectrophotométriques et très peu de techniques chromatographiques ont été rapportées. Dans une autre étude menée dans notre laboratoire, nous avons mis au point une technique de quantification du CR uniquement à partir d’un produit de soins capillaires commercialisé, en utilisant une technique d’élution isocratique par chromatographie liquide. Cette méthode n’est cependant pas adaptée à la quantification du DP dans ce type de formulation, ce qui nous a incités à développer cette nouvelle technique. Pour le DP, une seule méthode validée de chromatographie sur fluide supercritique a été rapportée. La méthode décrit la quantification de la forme D active dans un mélange racémique des formes D et L du panthénol dans une formulation cosmétique en utilisant un détecteur de spectroscopie de masse. Dans l’étude actuelle, une technique simple, rapide, précise et validée pour la quantification simultanée du DP et du RC à partir d’un produit de soins capillaires commercialisé, en présence d’une matrice complexe comprenant de la glycérine, de l’éthanol, de la biotine, de l’hydrolysat de kératine, de l’hyalkyl HBU, de l’acide nicotinique et de la polyvinylpyrrolidone, est présentée.

2. matériel et méthodes

L’étalon de dexpanthénol (DP) (pureté 99,65%) et l’étalon de résorcinol (RC) (pureté 99,98%) ont été achetés chez Sigma Aldrich India Ltd. Une formulation de soins capillaires contenant du DP et du RC avec le numéro de lot HV1124, la date de fabrication de février 2015 et la date d’expiration de juillet 2017 a été utilisée comme une formulation commercialisée représentative pour l’étude. Les solvants de qualité chromatographique ont été achetés auprès de Spectrochem India Limited. Une colonne C18 de 100 mm de long et de 4,0 mm de diamètre interne a été achetée auprès de Waters Limited (Waters MA, USA). Tous les réactifs utilisés dans l’analyse ont été achetés chez Merck India Limited.

2.1. Equipement et conditions chromatographiques

Un module de séparation Alliance de Waters (Waters, USA) système à gradient quaternaire et un détecteur d’absorbance lambda double de Waters 2489 ont été utilisés à des fins de quantification. L’analyse a été réalisée à l’aide du logiciel Empower 3 (Waters, USA). Une colonne C18 de Waters (Waters, USA) en phase inverse d’une longueur de 100 mm, d’un diamètre interne de 4,0 mm, d’une taille de particule de 5 μm et d’un débit d’élution en gradient de 0,6 mL/min a été utilisée pour l’analyse. La phase mobile était une combinaison de tampon phosphate 5,4 mM filtré et dégazé (pH = 2,8) et d’acétonitrile (ACN) dans les proportions présentées dans le tableau 1.

L’analyse a été réalisée à température ambiante et le volume d’injection était de 20 μL. La longueur d’onde de détection était de 210 nm pour le DP et de 280 nm pour le RC. Avant la séparation chromatographique, les deux solutions standard et les solutions d’échantillon ont été filtrées à travers un filtre à membrane de 0,2 μm (Pall Life science, Inde).

2.2. Préparation des solutions standards et des solutions échantillons

2.2.1. Solution standard

Les solutions mères de RC et DP ont été préparées en dissolvant 51,68 mg de RC (solution A) et 52,19 mg de DP (solution B) dans 100 mL de diluants (90% de tampon et 10% d’acétonitrile) dans deux fioles volumétriques distinctes, propres et sèches, à l’aide d’ultrasons. La solution A a été diluée dans la plage de 10,34 μg-mL-1 à 82,69 μg-mL-1 et la solution B de 10,44 μg-mL-1 à 83,50 μg-mL-1 en utilisant les diluants pour l’analyse (tableau 1). La courbe de l’aire de pic en fonction de la concentration a été préparée (Figure 1(a) pour RC et Figure 1(b) pour DP) et a été utilisée pour la détermination de la linéarité de la méthode et la même courbe a été utilisée à des fins de quantification. Les résultats ont été présentés dans le tableau 2 (a et b) pour RC et DP, respectivement. L’ajustement de la courbe a été effectué selon la méthode des moindres carrés.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Figure 1

Structure chimique du résorcinol (a) et du dexpanthénol (b).

2.2.2. Solution d’échantillon

La préparation de la solution d’échantillon était critique lorsqu’un certain nombre de substances interférentes étaient présentes au sein de la matrice comme la glycérine, l’éthanol, la biotine, l’hydrolysat de kératine, l’hyalkyl HBU, l’acide nicotinique et la polyvinylpyrrolidone. Cependant, dans notre étude, la méthode a été optimisée en suivant une technique simple de préparation de l’échantillon en une seule étape, ce qui était tout à fait approprié pour l’analyse régulière. 2 mL de la formulation ont été prélevés à la pipette avec précision et transférés dans une fiole volumétrique propre et sèche, puis dilués à 25 mL avec la phase mobile. Cette solution a été injectée dans le système chromatographique après avoir été filtrée à travers un filtre à membrane de 0,2 μm.

2.2.3. Validation de la méthode

La technique de chromatographie liquide à haute performance pour la quantification simultanée de RC et DP a été réalisée suivant la méthode d’étalonnage externe . La méthode analytique a été validée sur la base de l’exactitude, la précision, la linéarité, la gamme et la robustesse de la méthode. La fiabilité et la précision de la méthode proposée ont été déterminées sur la base d’études de récupération. La solution d’échantillon a été dopée avec la solution mère standard à trois niveaux différents (80 %, 110 % et 120 % de la valeur d’essai pour chacun des RC et DP étiquetés RA, RB et RC et DA, DB et DC, respectivement). La précession de la méthode a été étudiée sur la base de la précession de six injections répétées de la solution standard. La linéarité a été établie par la préparation de la courbe de linéarité standard dans la plage de concentration de 10,34 μg-mL-1 à 82,69 μg-mL-1 pour RC et de 10,44 μg-mL-1 à 83,50 μg-mL-1 pour DP (figure 2). Les mêmes courbes ont été utilisées à des fins de quantification. La précision intrajournalière a été calculée à l’aide de six injections dans la plage de concentration la plus élevée (41,34 μg-mL-1 pour RC et 41,75 μg-mL-1 pour DP) le même jour et à des jours différents pour obtenir la précision interjournalière. L’étude de la pureté du pic a été utilisée pour déterminer la spécificité de la méthode. Un détecteur à barrettes de photodiodes (PDA) a été utilisé à cet effet à la place du détecteur UV mentionné précédemment, les autres conditions chromatographiques restant inchangées. La limite de quantification (LOQ) et la limite de détection (LOD) ont été déterminées selon la technique décrite ailleurs. La robustesse de la méthode a été déterminée en effectuant des expériences sur des instruments de marques différentes. De légères modifications des conditions chromatographiques comme la composition (±5%) et le pH (±0,1%) de la phase mobile ont été effectuées afin d’étudier la robustesse de la méthode.

(a)

(b)

(a)
(b).

Le résultat obtenu à chaque étape a été soumis à une analyse statistique basée sur le logiciel Sigma plot (version 8.02 SPSS Inc, USA) et MS Excel 2007. Les données ont été enregistrées en réplicats et présentées sous forme de moyenne ± écart-type des mesures répétées.

3. Résultats et discussions

Le temps d’exécution moyen pour l’analyse était de 28 minutes et le temps de rétention moyen pour le RC était de minutes et pour le DP était de minutes et pour le RC et le DP était de minutes et de minutes dans les solutions d’échantillons. Une résolution suffisante a été observée entre RC et DP dans le chromatogramme standard et le chromatogramme de l’échantillon et les pics d’élution proches ont montré une résolution suffisante dans le chromatogramme de l’échantillon (Figures 3 et 4). Il s’agit probablement de la première technique rapportée pour la quantification simultanée de ces deux substances à partir d’un produit de soin capillaire commercialisé. pour le RC a été trouvé à 280 nm et pour le DP à 210 nm. L’analyse a donc été effectuée à l’aide d’un détecteur d’absorption lambda double avec balayage simultané à 210 nm et 280 nm. La pureté chromatographique de chaque composant a été analysée à l’aide d’un détecteur PDA pour chaque composant considéré. L’angle de pureté du pic pour RC et DP était de 0,129 et 0,217, respectivement, et le seuil de pureté du pic était de 0,337 et 0,411, respectivement. Ainsi, les pics des analytes étaient symétriques, purs et spectralement homogènes et il y a une résolution suffisante entre les pics respectifs des analytes dans le chromatogramme de l’échantillon (figures 3(b) et 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b).

Figure 3

Chromatogrammes représentatifs de l’étalon de résorcinol (a) et de l’échantillon (b).

(a)

(b)

.
(a)
(b)

3.1. Validation de la méthode mise au point

La quantification du RC a été effectuée sur la base de la surface du pic et pour le DP sur la base de la hauteur du pic. La méthode d’analyse discutée précédemment a été validée selon les directives USP et ICH Q2(R1). Les paramètres respectifs à étudier ont été présentés comme suit.

3.1.1. Aptitude du système

L’aptitude du système chromatographique à effectuer l’analyse a été étudiée sur la base de l’aptitude du système. Elle était généralement représentée en termes d’efficacité de la colonne, de résolution, de facteur de capacité et de facteur de queue. Les plateaux théoriques généralement présentés à l’aide de la lettre «  » définissent l’efficacité de la colonne, une mesure de la netteté des pics, et sont importants pour la détection de composants à l’état de traces. La détermination de la résolution des pics ou du facteur de résolution «  » a été effectuée pour s’assurer que les composés étroitement élués étaient bien séparés les uns des autres, pour s’assurer du pouvoir de résolution général du système et également pour s’assurer que les normes internes étaient bien résolues pour le pic de l’analyte. Le facteur de capacité «  » est une mesure de la répartition de la masse de l’analyte entre la phase stationnaire et la phase mobile. L’asymétrie du pic est généralement exprimée en termes de facteur de symétrie ou de facteur de queue. Une valeur de 1 a été attribuée à un pic parfaitement symétrique et cette valeur augmente avec l’augmentation de l’empilement des pics. Pour un pic parfaitement symétrique, sa valeur était l’unité et la même augmente au fur et à mesure que l’empilement du pic devient plus prononcé. Les résultats ont été résumés en plaques théoriques ( pour RC et pour DP), en facteur de capacité ( pour RC et 1,32 pour DP), en asymétrie de pic ou en facteur de tailing ( pour RC et 0,56 pour DP) (tableau 3) .

3.1.2. Linéarité et gamme

Pour étudier la linéarité de la méthode, des solutions étalons dans la gamme de concentration de 3,08 μg-mL-1 à 24,67 μg-mL-1 pour RC et de 10,44 μg-mL-1 à 83,50 μg-mL-1 pour DP ont été utilisées. Le résultat obtenu lors de l’analyse a été utilisé pour préparer la courbe de linéarité. La courbe ainsi obtenue s’est avérée être linéaire avec un facteur de régression et une équation pour RC et et une équation pour DP (Figure 2). La limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) déterminées à l’aide de la courbe de linéarité étaient respectivement de 2,19 μg-mL-1 et 6,64 μg-mL-1 pour RC, 0,62 μg-mL-1 et 1,89 μg-mL-1 pour DP (tableau 3). Les résultats ont expliqué la sensibilité de la technique dans la gamme d’analyse considérée .

3.1.3. Précision

La précision était une mesure de la proximité des résultats d’analyse obtenus par cette procédure par rapport à la valeur réelle. Il est nécessaire d’établir la précision de la procédure dans la gamme de concentration considérée. Dans cette étude, la précision a été analysée sur la base d’une étude de récupération. Trois solutions différentes à des plages de concentration de 80 %, 110 % et 120 % de la concentration calculée du test ont été préparées pour DP et RC, respectivement. Les solutions ont été préparées en ajoutant un volume connu de solutions standard (solutions A et B) aux solutions d’échantillon respectives. Les résultats ont présenté une récupération moyenne de 100,28% avec % RSD 0,82 pour RC et 100,02% et 0,48, respectivement, pour DP (Tableau 4). Par conséquent, une précision appréciable a été établie sur la gamme d’étude .

3.1.4. Précession

Dans notre étude la précession a été établie sur la base de l’écart type ou de l’écart type relatif d’une série de mesures comme la répétabilité et la précession intermédiaire de la technique développée. Pour l’étude de répétabilité, six solutions d’échantillon à 100% de la concentration d’essai ont été préparées séparément et analysées en utilisant la procédure analytique étudiée. La même solution d’échantillon a été injectée en triplicat pendant trois jours consécutifs et le résultat ainsi obtenu a été utilisé pour déterminer la précession intermédiaire. La précession intra-journalière a présenté une valeur de % RSD de 0,19 et celle de l’inter-journalière a varié de 0,19% à 0,21% seulement pour RC et 0,20 et 0,11 à 0,19 pour DP rendant la procédure analytique précise dans la gamme d’étude (tableau 2).

3.1.5. Spécificité

L’évaluation sans équivoque de l’analyte considéré à partir d’un mélange de composants comme les impuretés, les produits de dégradation et les composants de la matrice a été appelée spécificité . Dans cette étude, la spécificité du DP et du RC a été déterminée sur la base de l’étude de la pureté des pics chromatographiques des solutions échantillons. Un pic n’était considéré comme spectralement homogène, c’est-à-dire exempt de coélution, que lorsque l’angle de pureté du pic était inférieur au seuil. L’étude a présenté l’angle de pureté de pic pour RC et DP 0,129 et 0,217, respectivement, et le seuil de pureté de pic 0,337 et 0,411, respectivement (Tableau 3). Par conséquent, il a été conclu que les pics respectifs étaient spectralement homogènes, exempts d’impuretés coeluches et spécifiques pour l’analyse simultanée du RC et du DP.

3.1.6. Robustesse

La robustesse était habituellement définie comme la capacité d’une procédure analytique à ne pas être affectée par l’introduction de variations faibles mais délibérées des paramètres de procédure énumérés dans la documentation de la procédure et à présenter une indication de sa stabilité au cours d’analyses régulières. La robustesse de la méthode actuelle a été étudiée sur la base des variations de l’analyste, des instruments et de la stabilité de la solution et sur différentes conditions de stockage. Les résultats ont été trouvés dans les limites de tolérance (tableau 5).

La méthode actuelle s’est avérée robuste pour la quantification simultanée du RC et du DP (tableau 5) à des concentrations aussi faibles que 6,64 μg-mL-1 pour le RC et 1.89 μg-mL-1 pour DP (tableau 2).

4. Conclusion

La technique de chromatographie liquide haute performance en phase inverse développée dans la présente étude était simple en termes de préparation et d’analyse des échantillons, sensible et sélective pour la quantification du résorcinol et du dexpanthénol simultanément, et précise et exacte pour leur quantification simultanée à partir d’une matrice complexe. La méthode a été validée en termes de précision, de précession, de linéarité et de sensibilité conformément aux directives ICH Q2(R1). Le temps de rétention respectif pour DP et RC était de 3,19 minutes et 7,2 minutes. Les pics étaient bien séparés les uns des autres et des autres pics d’élution proches. Ainsi, la méthode actuelle est appropriée pour l’analyse de routine, les tests de stabilité et la quantification simultanée de RC et DP à partir de diverses formulations disponibles sur le marché.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.

Remerciements

Les auteurs remercient tous les membres de la section R&D pour leur aimable coopération et leur soutien. Les auteurs remercient également la direction et les membres du conseil d’administration pour leur soutien et leurs encouragements inestimables.