Abstract

O presente estudo apresenta a quantificação simultânea do dexpantenol e do resorcinol a partir da formulação dos cuidados capilares comercializados. O dexpantenol está frequentemente presente como ingrediente activo em produtos de cuidados pessoais pelas suas propriedades embelezadoras e revigorantes e pelas suas propriedades restauradoras e suavizantes. Por outro lado, o resorcinol é prescrito principalmente para o tratamento da dermatite seborreica do couro cabeludo. Os efeitos secundários tóxicos do resorcinol limitam a sua utilização em preparações dermatológicas. Portanto, uma técnica de quantificação precisa para a estimativa simultânea desses dois componentes pode ser útil para as indústrias de formulação para a análise precisa da qualidade de seus produtos. No estudo atual foi desenvolvida uma técnica cromatográfica líquida de alto desempenho utilizando uma coluna C18 e uma fase móvel composta por tampão fosfato de pH = 2,8 após uma eluição gradiente. O fluxo da fase móvel foi de 0,6 mL por minuto e o comprimento de onda de detecção foi de 210 nm para o dexpantenol e 280 nm para o resorcinol. O estudo de linearidade foi realizado utilizando cinco soluções com concentrações entre 10,34 μg-mL-1 e 82,69 μg-mL-1 () para o resorcinol e 10,44 μg-mL-1 e 83,50 μg-mL-1 () para o dexpantenol. O método foi validado de acordo com as diretrizes da ICH Q2(R1). A facilidade de preparação da amostra em uma única etapa, precisão e estudo de precisão (intradiário e inter-dia) apresenta o método adequado para a quantificação simultânea do dexpantenol e resorcinol de qualquer produto de cuidados pessoais e preparações dermatológicas contendo estes dois ingredientes.

1. Introdução

Dexpantenol (DP) é o análogo alcoólico do ácido D-pantotênico. Quimicamente é 2,4-dihidroxi-N-(3-hidroxipropil)-3,3-dimetil-1-butanamida comumente presente como ingrediente ativo em diversos suplementos e cosméticos (cremes, pomadas, loções, etc.) de Vitamina B-complexa por suas propriedades embelezadoras e tonificantes e propriedades restauradoras e suavizantes. O DP é absorvido através da pele e converte-se na sua forma activa, o ácido pantoténico (Vitamina B5), precursor da biossíntese da coenzima A. A forma ácida desempenha um papel importante no Ciclo de Krebs . O ácido pantotênico também é considerado como “vitaminas antistress”, pois sua deficiência pode resultar em diferentes tipos de doenças como irritação da pele, dermatite, despigmentação do cabelo e crescimento atordoado. Nas preparações dermatológicas, é normalmente administrado em potências de 2 a 5%. Devido às suas propriedades restauradoras, suavizantes e antidermatites e despigmentação, é frequentemente utilizado em produtos de tratamento capilar e algumas formulações vitamínicas.

O próximo candidato em nosso estudo é o resorcinol (RC) ou benzeno-1,3-diol. Ele tem uma série de aplicações farmacêuticas como tratamento de acaína, dermatite seborréica, eczema, psoríase e outros distúrbios cutâneos. Também é usado em agentes de coloração capilar. No entanto, esta molécula tem uma série de efeitos secundários no uso a longo prazo ou em grandes dosagens. Pesquisas mostram que o uso a longo prazo de RC leva a efeitos reversíveis na glândula tireóide humana resultando em hipotiroidismo . Portanto, um método exato para a quantificação de RC a partir de formulações prescritas para uso medicinal e cosmético é essencial.

Preparações cosméticas e farmacêuticas severas contêm RC e DP tanto na forma de excipientes ou como componentes ativos e muito poucos métodos foram relatados para sua quantificação a partir de tais formulações. Mais uma vez a maioria das técnicas relatadas apresentam métodos para RC ou DP. A maioria dos métodos descritos para a quantificação de RC são técnicas espectrofotométricas e muito poucas técnicas cromatográficas relatadas. Em outro estudo realizado em nosso laboratório desenvolvemos uma técnica para a quantificação de RC apenas a partir de um produto de tratamento capilar comercializado, utilizando uma técnica de eluição isocrática por cromatografia líquida. Este método não é, no entanto, adequado para a quantificação de RC a partir de tal formulação, o que nos inspirou para o desenvolvimento desta técnica mais recente. Para o DP apenas um único método de cromatografia líquida supercrítica validado foi relatado. O método descreve a quantificação da forma D ativa em uma mistura racêmica de formas D e L de pantenol de formulação cosmética usando um detector espectroscópico de massa. No presente estudo é apresentada uma técnica simples, rápida, precisa e validada para a quantificação simultânea do DP e RC de um produto de tratamento capilar comercializado, na presença de uma matriz complexa composta por glicerina, etanol, biotina, queratina hidrolisada, hialquil HBU, ácido nicotínico e polivinilpirrolidona.

2. Material e Métodos

Padrão de expantenol (DP) (pureza 99,65%) e padrão de resorcinol (RC) (pureza 99,98%) foram adquiridos da Sigma Aldrich India Ltd. A formulação de tratamento capilar contendo DP e RC com número de lote HV1124, data de fabricação Fevereiro 2015, e data de validade Julho 2017 foi utilizada como formulação representativa comercializada para estudo. Os solventes de grau de cromatografia foram adquiridos da Spectrochem India Limited. Uma coluna C18 de 100 mm de comprimento e 4,0 mm de diâmetro interno foi comprada da Waters Limited (Waters MA, EUA). Todos os reagentes utilizados em análise foram comprados da Merck India Limited.

2.1. Equipamento e Condições Cromatográficas

A Waters Alliance Separation Module (Waters, EUA) sistema de gradiente quaternário e Waters 2489 detector de absorbância dupla lambda foram usados para fins de quantificação. A análise foi realizada utilizando o software Empower 3 (Waters, EUA). Para a análise foi utilizada uma coluna C18 de fase reversa (Waters, EUA) de 100 mm de comprimento, 4,0 mm de diâmetro interno, 5 μm tamanho de partícula, e uma taxa de fluxo de eluição de gradiente de 0,6 mL/min. A fase móvel foi uma combinação de tampão fosfato filtrado e desgaseificado 5,4 mM (pH = 2,8) e acetonitrilo (ACN) em proporções como apresentado na Tabela 1.

A análise foi realizada à temperatura ambiente e o volume de injeção foi de 20 μL. O comprimento de onda de detecção foi de 210 nm para DP e 280 nm para RC. Antes da separação cromatográfica tanto a solução padrão quanto a amostra foram filtradas através do filtro de membrana 0,2 μm (Pall Life Science, Índia).

2,2. Preparação de soluções padrão e soluções de amostra

2.2.1. Solução Padrão

As soluções de reserva de RC e DP foram preparadas dissolvendo 51,68 mg de RC (solução A) e 52,19 mg de DP (solução B) em 100 mL de diluentes (tampão 90% e acetonitrilo 10%) em dois frascos volumétricos limpos e secos separados, usando ultra-som. A solução A foi diluída na faixa de 10,34 μg-mL-1 a 82,69 μg-mL-1 e a solução B 10,44 μg-mL-1 a 83,50 μg-mL-1 usando os diluentes para análise (Tabela 1). A área de pico versus curva de concentração foi preparada (Figura 1(a) para RC e Figura 1(b) para DP) e foi utilizada para a determinação da linearidade do método e a mesma foi utilizada para fins de quantificação. Os resultados foram apresentados nas Tabelas 2(a) e 2(b) para RC e DP, respectivamente. A finalidade do ajuste da curva foi realizada seguindo o método dos mínimos quadrados.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 1

Estrutura química do resorcinol (a) e do dexpantenol (b).

2.2.2. Solução de Amostra

A preparação da solução de amostra foi crítica quando uma série de substâncias interferentes estavam presentes na matriz como glicerina, etanol, biotina, queratina hidrolisada, HBU hialquil, ácido nicotínico e polivinilpirrolidona. Entretanto, em nosso estudo, o método foi otimizado seguindo uma técnica simples de preparação de amostras em uma única etapa, que foi muito adequada para a análise regular. 2 mL da formulação foram pipetados com precisão e transferidos para um frasco volumétrico limpo e seco e diluídos para 25 mL com fase móvel. Esta solução foi injetada no sistema cromatográfico após filtração através do filtro de membrana 0,2 μm.

2,2.3. Validação do Método

A técnica de cromatografia líquida de alto desempenho para quantificação simultânea de RC e DP foi realizada seguindo o método de calibração externa . O método analítico foi validado com base na precisão, precisão, linearidade, alcance e robustez do método. A confiabilidade e a precisão do método proposto foram determinadas com base em estudos de recuperação. A solução da amostra foi enriquecida com solução de reserva padrão em três níveis diferentes (80%, 110% e 120% do valor do ensaio para cada um dos RC e DP rotulados como RA, RB e RC e DA, DB e DC, resp.) . A precessão do método foi estudada com base na precessão de seis injeções em réplicas da solução padrão. A linearidade foi estabelecida através da preparação da curva de linearidade padrão na faixa de concentração de 10,34 μg-mL-1 a 82,69 μg-mL-1 para RC e 10,44 μg-mL-1 a 83,50 μg-mL-1 para DP (Figura 2). As mesmas curvas foram utilizadas para fins de quantificação. A precisão intradiária foi calculada utilizando seis injeções na faixa de maior concentração (41,34 μg-mL-1 para RC e 41,75 μg-mL-1 para DP) no mesmo dia e em dias diferentes para obter a precisão inter-dia. O estudo de pureza de pico foi utilizado para determinar a especificidade do método. Um detector de fotodíodos (PDA) foi utilizado para a finalidade no lugar do detector de UV mencionado anteriormente, mantendo as outras condições cromatográficas inalteradas. O limite de quantificação (LOQ) e o limite de detecção (LOD) foram determinados seguindo a técnica descrita em outra parte. A robustez do método foi determinada pela realização de experimentos com instrumentos de diferentes marcas. Pequenas alterações nas condições cromatográficas como composição (±5%) e pH (±0,1%) da fase móvel foram feitas a fim de estudar a robustez do método.

(a)

(b)

(a)
(b)

O resultado obtido em cada etapa foi submetido a análise estatística baseada no software de plotting Sigma (Versão 8.02 SPSS Inc.), EUA) e no MS Excel 2007. Os dados foram registrados em réplicas e apresentados como média ± desvio padrão das medidas das réplicas.

3. Resultados e Discussões

O tempo médio de execução para análise foi de 28 minutos e o tempo médio de retenção para RC foi de minutos e para DP foi de minutos e para RC e DP foi de minutos e minutos em soluções amostrais. Foi observada resolução suficiente entre RC e DP no cromatograma padrão e no cromatograma da amostra e os picos de eluição estreita mostraram resolução suficiente no cromatograma da amostra (Figuras 3 e 4). Esta foi provavelmente a primeira técnica relatada para a quantificação simultânea de ambos a partir do produto de tratamento capilar comercializado. para RC foi encontrada a 280 nm e para DP a 210 nm. Portanto, a análise foi realizada utilizando um detector de absorbância lambda duplo com varredura simultânea a 210 nm e 280 nm. A pureza cromatográfica para cada componente foi analisada utilizando um detector PDA para cada componente em consideração. O ângulo de pureza de pico para RC e DP foi de 0,129 e 0,217, respectivamente, e o limiar de pureza de pico foi de 0,337 e 0,411, respectivamente. Assim, os picos de analito foram simétricos, puros e espectralmente homogêneos e há resolução suficiente entre os respectivos picos de analito no cromatograma da amostra (Figuras 3(b) e 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

(a)

(b)

(a)
(b)

3.1. Validação do Método Desenvolvido

A quantificação do RC foi realizada com base na área do pico e para o DP com base na altura do pico. O método de análise discutido anteriormente foi validado de acordo com as diretrizes USP e ICH Q2(R1). Os respectivos parâmetros de estudo foram apresentados da seguinte forma.

3.1.1. Adequação do sistema

A adequação do sistema cromatográfico para a realização da análise foi estudada com base na adequação do sistema. Foi geralmente representada em termos de eficiência da coluna, resolução, fator de capacidade e fator de cauda. As placas teóricas geralmente apresentadas utilizando a letra “” definem a eficiência da coluna, uma medida de acuidade de pico, e foram importantes para a detecção de componentes vestigiais. A determinação da resolução do pico ou fator de resolução “” foi realizada para garantir que os compostos eluídos de perto fossem bem separados uns dos outros, para garantir o poder de resolução geral do sistema e também para garantir que os padrões internos fossem bem resolvidos para o pico do analito. O fator de capacidade “” foi uma medida para a distribuição da massa do analito entre a fase estacionária e a fase móvel. A assimetria do pico era normalmente expressa em termos de fator de simetria ou fator de cauda. Um valor de unidade foi atribuído para um pico perfeitamente simétrico e o mesmo aumenta com o aumento do pico de cauda. Para um pico perfeitamente simétrico seu valor era a unidade e os mesmos aumentos com o aumento do fator de cauda se tornam mais pronunciados. Os resultados foram resumidos em placas teóricas (para RC e para DP), fator de capacidade (para RC e 1,32 para DP), assimetria de pico, ou fator de rejeição (para RC e 0,56 para DP) (Tabela 3) .

3.1.2. Linearidade e amplitude

Para estudar a linearidade do método, foram utilizadas soluções padrão na faixa de concentração de 3,08 μg-mL-1 a 24,67 μg-mL-1 para RC e 10,44 μg-mL-1 a 83,50 μg-mL-1 para DP. O resultado obtido da análise foi utilizado para preparar a curva de linearidade. A curva assim obtida foi encontrada linear com fator de regressão e equação para RC e equação para DP (Figura 2). O limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) determinados através da curva de linearidade foram 2,19 μg-mL-1 e 6,64 μg-mL-1 para RC, 0,62 μg-mL-1 e 1,89 μg-mL-1 para DP, respectivamente (Tabela 3). Os resultados explicaram a sensibilidade da técnica dentro do intervalo de análise em consideração .

3.1.3. Precisão

A precisão foi uma medida de aproximação dos resultados do teste obtido por aquele procedimento em comparação com o valor verdadeiro. É necessário estabelecer a exatidão do procedimento na faixa de concentração em consideração. Neste estudo, a exatidão foi analisada com base no estudo de recuperação. Três soluções diferentes nas faixas de concentração 80%, 110% e 120% da concentração calculada no ensaio foram preparadas para DP e RC, respectivamente. As soluções foram preparadas adicionando um volume conhecido das soluções padrão (soluções A e B) às respectivas soluções de amostra. Os resultados apresentaram uma recuperação média de 100,28% com % RSD 0,82 para RC e 100,02% e 0,48, respectivamente, para DP (Tabela 4). Portanto, foi estabelecida uma precisão apreciável ao longo do intervalo de estudo.

3.1.4. Precessão

Em nosso estudo a precessão foi estabelecida com base no desvio padrão ou desvio padrão relativo de uma série de medidas como repetibilidade e precessão intermediária da técnica desenvolvida. Para o estudo de repetibilidade foram preparadas e analisadas separadamente seis soluções amostrais a 100% da concentração do teste, utilizando o procedimento analítico em estudo. A mesma solução da amostra foi injetada em triplicata por três dias consecutivos e o resultado assim obtido foi utilizado para determinar a precessão intermediária. A precessão intradiária apresentou um valor RSD de 0,19 % e a intercessão inter-dia variou de 0,19% a 0,21% apenas para RC e 0,20 e 0,11 a 0,19 para DP, tornando o procedimento analítico preciso sob a faixa de estudo (Tabela 2).

3,1,5. Especificidade

A avaliação inequívoca do analito em consideração a partir de uma mistura de componentes como impurezas, produtos de degradação e componentes de matriz foi denominada como especificidade . Neste estudo, a especificidade tanto do DP quanto do RC foi determinada com base no estudo cromatográfico dos picos de pureza das soluções da amostra. Um pico foi considerado espectralmente homogêneo, ou seja, livre de coeluição, somente quando o ângulo de pureza do pico era menor que o limiar. O estudo apresentou o ângulo de pureza de pico para RC e DP 0,129 e 0,217, respectivamente, e o limiar de pureza de pico 0,337 e 0,411, respectivamente (Tabela 3). Portanto, concluiu-se que os respectivos picos foram espectralmente homogêneos, livres de quaisquer impurezas coelutantes e específicos para a análise simultânea de RC e DP.

3.1.6. Robustez

A robustez foi geralmente definida como a capacidade de um procedimento analítico de permanecer inalterado na introdução de pequenas mas deliberadas variações dos parâmetros procedimentais listados na documentação do procedimento e apresentar uma indicação de sua estabilidade durante a análise regular. A robustez do método atual foi estudada com base em variações na estabilidade do analista, dos instrumentos e das soluções e em diferentes condições de armazenamento. Os resultados foram encontrados dentro dos limites de tolerância (Tabela 5).

O método actual foi considerado robusto para a quantificação simultânea de RC e DP (Tabela 5) em concentrações tão baixas como 6,64 μg-mL-1 para RC e 1.89 μg-mL-1 para DP (Tabela 2).

4. Conclusão

A técnica cromatográfica líquida de alta performance de fase reversa desenvolvida no presente estudo foi simples em termos de preparo e análise da amostra, sensível e seletiva para a quantificação simultânea de resorcinol e dexpantenol, e precisa e precisa para sua quantificação simultânea a partir de uma matriz complexa. O método foi validado em termos de precisão, precessão, linearidade e sensibilidade de acordo com as diretrizes da ICH Q2(R1). O respectivo tempo de retenção para DP e RC foi de 3,19 minutos e 7,2 minutos. Os picos foram bem resolvidos entre si e outros picos estreitamente elucidativos. Assim, o método atual é adequado para análise de rotina, testes de estabilidade e quantificação simultânea de RC e DP a partir de várias formulações disponíveis no mercado.

Conflito de Interesses

Os autores declaram que não há conflito de interesses em relação à publicação deste trabalho.

Acreditos

Os autores reconhecem a todos os membros da seção R&D pela sua amável cooperação e apoio. Os autores também agradecem à direção e aos membros da diretoria pelo seu inestimável apoio e encorajamento.