Abstracto

El presente estudio presenta la cuantificación simultánea de dexpantenol y resorcinol de una formulación comercializada para el cuidado del cabello. El dexpantenol suele estar presente como ingrediente activo en los productos de cuidado personal por sus propiedades embellecedoras y tonificantes y por sus propiedades restauradoras y suavizantes. Por otro lado, el resorcinol se prescribe principalmente para el tratamiento de la dermatitis seborreica del cuero cabelludo. Los efectos secundarios tóxicos del resorcinol limitan su uso en los preparados dermatológicos. Por lo tanto, una técnica de cuantificación precisa para la estimación simultánea de estos dos componentes puede ser útil para las industrias de formulación para el análisis preciso de la calidad de sus productos. En el presente estudio se ha desarrollado una técnica de cromatografía líquida de alto rendimiento utilizando una columna C18 y una fase móvil consistente en tampón fosfato de pH = 2,8 siguiendo una elución en gradiente. El caudal de la fase móvil fue de 0,6 mL por minuto y la longitud de onda de detección fue de 210 nm para el dexpantenol y de 280 nm para el resorcinol. El estudio de linealidad se llevó a cabo utilizando cinco soluciones con concentraciones que oscilaban entre 10,34 μg-mL-1 y 82,69 μg-mL-1 () para el resorcinol y 10,44 μg-mL-1 y 83,50 μg-mL-1 () para el dexpantenol. El método ha sido validado según las directrices ICH Q2(R1). La facilidad de la preparación de la muestra en un solo paso, la exactitud y la precisión (intradía e interdía) del estudio presenta el método adecuado para la cuantificación simultánea de dexpantenol y resorcinol de cualquier producto de cuidado personal y preparaciones dermatológicas que contengan estos dos ingredientes.

1. Introducción

El dexpantenol (DP) es el análogo alcohólico del ácido D-pantoténico. Químicamente es 2,4-dihidroxi-N-(3-hidroxipropil)-3,3-dimetil-1-butanamida comúnmente presente como ingrediente activo en un número de suplementos del complejo de la vitamina B y cosméticos (cremas, ungüentos, lociones, etc.) por sus propiedades embellecedoras y tonificantes y propiedades restauradoras y suavizantes . La DP se absorbe a través de la piel y se convierte en su forma activa, el ácido pantoténico (vitamina B5), precursor de la biosíntesis de la coenzima A. La forma ácida desempeña un papel importante en el ciclo de Krebs. El ácido pantoténico también se considera como «vitaminas antiestrés», ya que su deficiencia puede provocar diferentes tipos de enfermedades como irritación de la piel, dermatitis, despigmentación del cabello y aturdimiento . En los preparados dermatológicos se suele administrar en concentraciones del 2 al 5%. Debido a sus propiedades restauradoras y suavizantes y a sus propiedades antidermatitis y despigmentantes, se utiliza a menudo en productos para el cuidado del cabello y en algunas fórmulas vitamínicas.

El siguiente candidato que estudiamos es el resorcinol (RC) o benceno-1,3-diol. Tiene una serie de aplicaciones farmacéuticas como el tratamiento de la acaína, la dermatitis seborreica, el eczema, la psoriasis y otros trastornos de la piel. También se utiliza en agentes de coloración del cabello. Sin embargo, esta molécula tiene una serie de efectos secundarios en el uso a largo plazo o en grandes dosis. Las investigaciones demuestran que el uso a largo plazo del CR produce efectos reversibles en la glándula tiroidea humana, provocando hipotiroidismo. Por lo tanto, es esencial disponer de un método exacto para la cuantificación del CR en las formulaciones prescritas para uso medicinal y cosmético.

Varias preparaciones cosméticas y farmacéuticas contienen tanto CR como DP, ya sea en forma de excipientes o como componentes activos, y se han descrito muy pocos métodos para su cuantificación en dichas formulaciones. Una vez más, la mayoría de las técnicas descritas presentan métodos para RC o DP. La mayoría de los métodos descritos para la cuantificación del CR son técnicas espectrofotométricas y muy pocas técnicas cromatográficas. En otro estudio realizado en nuestro laboratorio, desarrollamos una técnica para la cuantificación del CR sólo a partir de un producto comercializado para el cuidado del cabello, utilizando una técnica de elución isocrática mediante cromatografía líquida . Sin embargo, este método no es adecuado para la cuantificación de DP de dicha formulación, lo que nos inspiró para el desarrollo de esta nueva técnica. Para la DP sólo se ha descrito un único método validado de cromatografía de fluidos supercríticos. El método describe la cuantificación de la forma D activa en una mezcla racémica de las formas D y L del pantenol de la formulación cosmética utilizando un detector espectroscópico de masas. En el presente estudio se presenta una técnica sencilla, rápida, precisa y validada para la cuantificación simultánea de la forma D y la forma L de un producto comercializado para el cuidado del cabello, en presencia de una matriz compleja que comprende glicerina, etanol, biotina, hidrolizado de queratina, hialquil HBU, ácido nicotínico y polivinilpirrolidona.

2. Material y métodos

El estándar de Dexpantenol (DP) (pureza 99,65%) y el estándar de resorcinol (RC) (pureza 99,98%) se adquirieron en Sigma Aldrich India Ltd. La formulación para el cuidado del cabello que contiene DP y RC con número de lote HV1124, fecha de fabricación de febrero de 2015 y fecha de caducidad de julio de 2017 se utilizó como formulación comercializada representativa para el estudio. Los disolventes de grado cromatográfico se compraron a Spectrochem India Limited. Se compró una columna C18 de 100 mm de longitud y 4,0 mm de diámetro interno a Waters Limited (Waters MA, USA). Todos los reactivos utilizados en el análisis se compraron a Merck India Limited.

2.1. Equipo y condiciones cromatográficas

Se utilizó un sistema de gradiente cuaternario Waters Alliance Separation Module (Waters, USA) y un detector de absorbancia Waters 2489 dual lambda para la cuantificación. El análisis se realizó con el software Empower 3 (Waters, EE.UU.). Para el análisis se utilizó una columna de fase inversa Waters C18 (Waters, EE.UU.) de 100 mm de longitud, 4,0 mm de diámetro interno, 5 μm de tamaño de partícula y un flujo de elución en gradiente de 0,6 mL/min. La fase móvil fue una combinación de tampón fosfato 5,4 mM filtrado y desgasificado (pH = 2,8) y acetonitrilo (ACN) en las proporciones presentadas en la Tabla 1.

El análisis se realizó a temperatura ambiente y el volumen de inyección fue de 20 μL. La longitud de onda de detección fue de 210 nm para DP y 280 nm para RC. Antes de la separación cromatográfica, tanto las soluciones estándar como las de muestra se filtraron a través de un filtro de membrana de 0,2 μm (Pall Life science, India).

2.2. Preparación de las soluciones estándar y de las soluciones de muestra

2.2.1. Solución estándar

Las soluciones madre de RC y DP se prepararon disolviendo 51,68 mg de RC (solución A) y 52,19 mg de DP (solución B) en 100 mL de diluyentes (90% de tampón y 10% de acetonitrilo) en dos matraces aforados limpios y secos por separado utilizando ultrasonidos. La solución A se diluyó hasta el rango de 10,34 μg-mL-1 a 82,69 μg-mL-1 y la solución B de 10,44 μg-mL-1 a 83,50 μg-mL-1 utilizando los diluyentes para el análisis (Tabla 1). Se preparó una curva de área de pico frente a la concentración (Figura 1(a) para RC y Figura 1(b) para DP) y se utilizó para la determinación de la linealidad del método y lo mismo para la cuantificación. Los resultados se presentaron en la Tabla 2(a y b) para RC y DP, respectivamente. El propósito de ajuste de la curva se llevó a cabo siguiendo el método de mínimos cuadrados.

(a)

(b)

(a)
(b)

2.2.2. Solución de la muestra

La preparación de la solución de la muestra era crítica cuando había una serie de sustancias que interferían dentro de la matriz como la glicerina, el etanol, la biotina, el hidrolizado de queratina, el hyalkyl HBU, el ácido nicotínico y la polivinilpirrolidona. Sin embargo, en nuestro estudio, el método se ha optimizado siguiendo una técnica sencilla de preparación de la muestra en un solo paso que era muy adecuada para el análisis regular. Se pipetearon con precisión 2 mL de la formulación y se transfirieron a un matraz volumétrico limpio y seco y se diluyeron a 25 mL con fase móvil. Esta solución se inyectó en el sistema cromatográfico después de filtrar a través de un filtro de membrana de 0,2 μm.

2.2.3. Validación del método

La técnica de cromatografía líquida de alta resolución para la cuantificación simultánea de RC y DP se llevó a cabo siguiendo el método de calibración externa . El método analítico fue validado en base a la exactitud, precisión, linealidad, rango y robustez del método. La fiabilidad y exactitud del método propuesto se determinó sobre la base de estudios de recuperación. La solución de la muestra se enriqueció con una solución madre estándar a tres niveles diferentes (80%, 110% y 120% del valor del ensayo para cada uno de los RC y DP etiquetados como RA, RB y RC y DA, DB y DC, respectivamente). La precesión del método se estudió sobre la base de la precesión de seis inyecciones replicadas de la solución estándar. La linealidad se estableció mediante la preparación de la curva de linealidad estándar en el rango de concentración de 10,34 μg-mL-1 a 82,69 μg-mL-1 para RC y de 10,44 μg-mL-1 a 83,50 μg-mL-1 para DP (Figura 2). Las mismas curvas se utilizaron para la cuantificación. La precisión intradiaria se calculó utilizando seis inyecciones en el rango de concentración más alto (41,34 μg-mL-1 para RC y 41,75 μg-mL-1 para DP) en el mismo día y en días diferentes para obtener la precisión interdiaria. El estudio de la pureza de los picos se utilizó para determinar la especificidad del método. Para ello se utilizó un detector de matriz de fotodiodos (PDA) en lugar del detector UV mencionado anteriormente, manteniendo inalteradas las demás condiciones cromatográficas. El límite de cuantificación (LOQ) y el límite de detección (LOD) se determinaron siguiendo la técnica descrita en otro lugar. La robustez del método se determinó llevando a cabo el experimento en instrumentos de diferentes marcas. Se realizaron ligeros cambios en las condiciones cromatográficas como la composición (±5%) y el pH (±0,1%) de la fase móvil para estudiar la robustez del método.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 2

Curva de concentración frente a área de pico para los análisis RC (a) y DP (b).

El resultado obtenido de cada etapa se sometió a un análisis estadístico basado en el software Sigma plot (Versión 8.02 SPSS Inc, USA) y MS Excel 2007. Los datos se registraron en réplicas y se presentaron como media ± desviación estándar de las mediciones de las réplicas.

3. Resultados y discusiones

El tiempo medio de ejecución del análisis fue de 28 minutos y el tiempo medio de retención para RC fue de minutos y para DP fue de minutos y para RC y DP fue de minutos y minutos en las soluciones de muestra. Se observó una resolución suficiente entre RC y DP en el cromatograma estándar y en el cromatograma de la muestra, y los picos que eluyen estrechamente mostraron una resolución suficiente en el cromatograma de la muestra (Figuras 3 y 4). Esta fue probablemente la primera técnica reportada para la cuantificación simultánea de ambos a partir de un producto comercializado para el cuidado del cabello. para RC se encontró a 280 nm y para DP a 210 nm. Por lo tanto, el análisis se llevó a cabo utilizando un detector de absorbancia lambda doble con barrido simultáneo a 210 nm y 280 nm. La pureza cromatográfica para cada componente se analizó utilizando un detector PDA para cada componente considerado. El ángulo de pureza del pico para RC y DP fue de 0,129 y 0,217, respectivamente, y el umbral de pureza del pico fue de 0,337 y 0,411, respectivamente. Por lo tanto, los picos de los analitos eran simétricos, puros y espectralmente homogéneos y hay suficiente resolución entre los respectivos picos de los analitos en el cromatograma de la muestra (Figuras 3(b) y 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 3

Cromatogramas representativos del estándar de resorcinol (a) y de la muestra (b).

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Figura 4

Cromatograma representativo del patrón de dexpantenol (a) y de la muestra (b).

3.1. Validación del método desarrollado

La cuantificación de RC se llevó a cabo sobre la base del área del pico y para DP sobre la base de la altura del pico. El método de análisis discutido anteriormente fue validado según las directrices USP e ICH Q2(R1). Los parámetros respectivos para el estudio se presentaron como sigue.

3.1.1. Idoneidad del sistema

La idoneidad del sistema cromatográfico para realizar el análisis se estudió sobre la base de la idoneidad del sistema. Normalmente se representó en términos de eficiencia de la columna, resolución, factor de capacidad y factor de cola. Los platos teóricos que suelen presentarse con la letra «» definen la eficiencia de la columna, una medida de la nitidez de los picos, y eran importantes para la detección de componentes traza. La determinación de la resolución de los picos o del factor de resolución «» se llevó a cabo para garantizar que los compuestos que eluyen estrechamente estuvieran bien separados unos de otros, para asegurar el poder de resolución general del sistema y también para garantizar que los estándares internos estuvieran bien resueltos para el pico del analito. El factor de capacidad «» era una medida de la distribución de la masa del analito entre la fase estacionaria y la fase móvil. La asimetría de los picos suele expresarse en términos de factor de simetría o factor de cola. Se asignaba un valor de unidad para un pico perfectamente simétrico y el mismo aumenta con el incremento de la cola del pico. Para un pico perfectamente simétrico su valor era la unidad y el mismo aumenta a medida que la cola se hace más pronunciada. Los resultados se resumieron como platos teóricos ( para RC y para DP), factor de capacidad ( para RC y 1,32 para DP), asimetría del pico o factor de cola ( para RC y 0,56 para DP) (Tabla 3) .

Umbral de pureza máxima Parámetros Resorcinol Dexpantenol Adecuación del sistema Tiempo de retención (min) 7.19 3.19 Factor de capacidad 1,08 1,32 Resolución máxima 15.41 – Factor de cola 0,97 0.56 Placas teóricas () Sensibilidad LOD (µg-mL-1) 2.19 0,62 LOQ (µg-mL-1) 6,64 1.89 Precisión Intradía Contenido medio (mg/100 mL) () ± % RSD 50.41 ± 0.19 49.77 ± 0.20 Día Contenido medio (mg/100 mL) (día 1/día 2/día 3) () 50.40/50,38/50,39 49,76/49,78/49,65 (% RSD) (día 1/día 2/día 3) () 0,20/0,19/0.21 0,11/0,19/0,15 Especificidad Ángulo de máxima pureza 0.129 0,217 0,337 0.411

Respecto a DP.

Tabla 3

Datos de idoneidad del sistema y de validación del método para la cuantificación simultánea de DP y RC.

3.1.2. Linealidad y rango

Para estudiar la linealidad del método, se utilizaron soluciones estándar en un rango de concentración de 3,08 μg-mL-1 a 24,67 μg-mL-1 para RC y de 10,44 μg-mL-1 a 83,50 μg-mL-1 para DP. El resultado obtenido del análisis se utilizó para preparar la curva de linealidad. La curva así obtenida resultó ser lineal con factor de regresión y ecuación para RC y y ecuación para DP (Figura 2). El límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) determinados utilizando la curva de linealidad fueron 2,19 μg-mL-1 y 6,64 μg-mL-1 para RC, 0,62 μg-mL-1 y 1,89 μg-mL-1 para DP, respectivamente (Tabla 3). Los resultados explicaron la sensibilidad de la técnica dentro del rango de análisis considerado.

3.1.3. Exactitud

La exactitud fue una medida de la proximidad de los resultados de la prueba obtenidos por ese procedimiento en comparación con el valor verdadero. Es necesario establecer la exactitud del procedimiento en el rango de concentración considerado. En este estudio, la precisión se analizó sobre la base del estudio de recuperación. Se prepararon tres soluciones diferentes con rangos de concentración del 80%, 110% y 120% de la concentración de ensayo calculada para DP y RC, respectivamente. Las soluciones se prepararon añadiendo un volumen conocido de las soluciones estándar (soluciones A y B) a las respectivas soluciones de muestra. Los resultados presentaron una recuperación media del 100,28% con un % RSD de 0,82 para RC y 100,02% y 0,48, respectivamente, para DP (Tabla 4). Por lo tanto, se estableció una precisión apreciable en el rango de estudio .

Nota: media de tres inyecciones repetidas de preparaciones de muestras.
El estudio de recuperación se realiza en un rango de tres concentraciones.

Solución % del valor nominal para RC Concentración de la solución final en µg-mL-1 Recuperación % Concentración observada de la solución final (µg-mL-1) Valor medio del ensayo (mg-100 mL-1) Recuperación observada % Exactitud % % RSD 100 40.00 – 40,33 50,42 – – 0,20 RA 80 32.00 80.00 32.27 40.35 80.03 100.03 RB 110 44.03 110.07 44.93 56.17 111.40 101.21 0.82 RC 120 48,12 120,30 48,33 60,42 119,83 99.61 Solución % del valor nominal de la DP Concentración de la solución final en µg-mL-1 Recuperación % Concentración observada de la solución final (µg-mL-1) Valor medio del ensayo (mg-100 mL-1) Recuperación observada % Exactitud % % RSD 100 40.00 – 39.82 49.77 – – 0.02 DA 80 32,00 80,00 31,88 39.84 79,91 99,89 DB 110 44,12 110,30 44,05 55,09 110.69 100,35 0,48 DC 120 47,99 119,97 47,69 59,61 119.77 99,83

Tabla 4

Resultados del estudio de precisión.

3.1.4. Precesión

En nuestro estudio la precesión se estableció en base a la desviación estándar o desviación estándar relativa de una serie de medidas como la repetibilidad y la precesión intermedia de la técnica desarrollada. Para el estudio de la repetibilidad se prepararon por separado seis soluciones de muestra al 100% de la concentración de prueba y se analizaron utilizando el procedimiento analítico en estudio. La misma solución de muestra se inyectó por triplicado durante tres días consecutivos y el resultado así obtenido se utilizó para determinar la precesión intermedia. La precesión intradiaria presentó un valor de % RSD de 0,19 y la interdiaria varió de 0,19% a 0,21% sólo para RC y de 0,20 y 0,11 a 0,19 para DP haciendo que el procedimiento analítico sea preciso bajo el rango de estudio (Tabla 2).

3.1.5. Especificidad

La evaluación inequívoca del analito considerado a partir de una mezcla de componentes como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz se denominó especificidad. En este estudio, la especificidad de DP y RC se determinó sobre la base del estudio de la pureza de los picos cromatográficos de las soluciones de muestra. Un pico se consideró espectralmente homogéneo, es decir, libre de coelución, sólo cuando el ángulo de pureza del pico era inferior al umbral. El estudio presentó el ángulo de pureza del pico para RC y DP 0,129 y 0,217, respectivamente, y el umbral de pureza del pico 0,337 y 0,411, respectivamente (Tabla 3). Por lo tanto, se concluyó que los respectivos picos eran espectralmente homogéneos, libres de cualquier impureza coeluyente, y específicos para el análisis simultáneo de RC y DP.

3.1.6. Robustez

La robustez se definió normalmente como la capacidad de un procedimiento analítico de no verse afectado por la introducción de variaciones pequeñas pero deliberadas de los parámetros de procedimiento enumerados en la documentación del mismo y presentar una indicación de su estabilidad durante los análisis regulares. Se estudió la solidez del método actual en función de las variaciones del analista, de los instrumentos y de la estabilidad de la solución, así como de las diferentes condiciones de almacenamiento. Los resultados se encontraron dentro de los límites de tolerancia (Tabla 5).

Análisis (mg/100 mL) Analistas Instrumentos Condición de almacenamiento 1 2 3 I II III 20°C 30°C 45°C RC 50.42 50.41 50.40 50.44 50.41 50.42 50.42 50.42 50.40 50.40 DP 49.77 49.77 49.78 49.76 49.79 49.78 49.77 49.77 49,76 49,77

Tres réplicas cada una.

Tabla 5

Estudio de robustez.

El método actual resultó ser robusto para la cuantificación simultánea de RC y DP (Tabla 5) a concentraciones tan bajas como 6,64 μg-mL-1 para RC y 1.89 μg-mL-1 para DP (Tabla 2).

4. Conclusión

La técnica de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa desarrollada en el presente estudio fue sencilla en cuanto a la preparación y el análisis de la muestra, sensible y selectiva para la cuantificación de resorcinol y dexpantenol simultáneamente, y precisa y exacta para su cuantificación simultánea a partir de una matriz compleja. El método ha sido validado en términos de exactitud, precesión, linealidad y sensibilidad según las directrices ICH Q2(R1). El tiempo de retención respectivo para DP y RC fue de 3,19 minutos y 7,2 minutos. Los picos se resolvieron bien entre sí y con otros picos de elución cercana. Por lo tanto, el método actual es adecuado para el análisis de rutina, las pruebas de estabilidad y la cuantificación simultánea de RC y DP de varias formulaciones disponibles en el mercado.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no hay ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este trabajo.

Agradecimientos

Los autores agradecen a todos los miembros de la sección de R&D por su amable cooperación y apoyo. Los autores también agradecen a la dirección y a los miembros de la junta directiva su inestimable apoyo y estímulo.