Diskuse

Výsledky této studie poprvé ukazují klíčovou roli syntézy ergosterolu v odolnosti kvasinek vůči vysoušení/mokření (obr. 2). Nahrazení zymosterolu, nejstaršího sterolu EBP, který byl v této studii testován (kmen erg6Δ), ergosterolem umožnilo obnovit odolnost na úroveň pozorovanou u kmene WT (tabulka 2). Hlavní chemické přeměny, ke kterým dochází během biosyntetického procesu ze zymosterolu na ergosterol, jsou změna nasycení B-kruhu a alifatického ocasu (obr. 1B). Tyto postupné modifikace by mohly přispívat k optimalizaci biofyzikálních vlastností molekul v následujících krocích podél EBP a mohly by vysvětlit zvýšení odolnosti vůči cyklům sušení/vlhčení. Naše výsledky ukazují, že tři nejstarší testované mutanty (erg6Δ, erg2Δ a erg3Δ) jsou vysoce citlivé na vysoušení/vlhčení. První zlom ve zvyšování odolnosti podél EBP byl zjištěn u kmene erg5Δ. Ta se postupně zvyšovala u kmene erg4Δ, až dosáhla maximální hodnoty u kmene WT (obr. 2). Chemické struktury hlavních sterolů akumulovaných těmito třemi posledními kmeny se vyznačují přítomností dvou dvojných vazeb v kruhu B (obr. 1B). Tyto konjugované dvojné vazby umožňují při radikálovém útoku stabilizaci sterolových radikálů pomocí rezonance (delokalizace nepárového elektronu). Tato chemická vlastnost by mohla vysvětlit příznivý účinek na přežití při vysychání/vlhnutí, které zahrnuje oxidaci (Garre et al. 2010), tím, že chrání fosfolipidy před peroxidací stejně jako vitamin E (Packer 1991). Hlavní steroly akumulované třemi kmeny s mutacemi na počátku EBP mají unikátní dvojitou vazbu C-C v poloze C-7,8 nebo C-8,9, daleko od hydroxylové skupiny, což nepodporuje stabilizaci radikálu rezonancí. To by mohlo vysvětlit vysokou citlivost kmenů erg6Δ, erg2Δ a erg3Δ na sušení na atmosférickém vzduchu. Postupné zvyšování odolnosti směrem ke konci EBP (obr. 2), pozorované u kmenů erg5Δ, erg4Δ a WT, může souviset s rozdílem mezi alifatickými ocasy sterolů (obr. 1B). Struktura ocasu totiž ovlivňuje planaritu sterolů, která je určující pro jejich polohu v membráně (Xu a London 2000; Bakht a London 2006). Závěrečné kroky ergosterolové dráhy by tedy mohly umožnit lepší uložení sterolů v membráně a modifikovat parametry, jako je jejich hloubka v lipidové dvojvrstvě, a optimalizovat tak ochranu fosfolipidů před oxidací. Ochrana lipidů před oxidací zprostředkovaná steroly již byla prokázána na modelových membránách (Wiseman 1993), ale nikdy nebyla prokázána na biologických buňkách. Naše výsledky poprvé ukazují vztah mezi povahou sterolů a odolností vůči oxidaci. Podporují také hypotézu, která předpokládala, že steroly mohly dodávat buňkám odolnost vůči oxidaci při zvýšení hladiny kyslíku během okysličování Země (Galea a Brown 2009; Brown a Galea 2010). Autoři této studie skutečně dospěli k závěru, že syntéza sterolů, proces závislý na kyslíku (obr. 1A), mohla být adaptivní odpovědí na nárůst pozemského kyslíku.

Pokusy se sušením prováděné v dusíku vedly u všech testovaných kmenů k vyšší míře přežití než pokusy se sušením na vzduchu (obr. 2). Vliv nepřítomnosti kyslíku během sušení byl silný u kmenů s mutacemi v časných složkách EBP, snížil se u kmenů s mutacemi v pozdějších složkách EBP a byl zanedbatelný u kmene WT. Tyto výsledky ukazují, že oxidace hraje hlavní roli v letálním účinku sušení v atmosférických podmínkách. Jelikož však míra odumírání zůstala u erg6Δ, erg2Δ, erg3Δ a erg5Δ značná i při sušení v dusíku, dospěli jsme k závěru, že k odumírání buněk během sušení přispívají jiné faktory než oxidace. Jedním z těchto faktorů by mohlo být silné mechanické omezení plazmatické membrány v důsledku ztráty vody z buněk osmotickým přenosem (Dupont et al. 2010). Je totiž známo, že povaha sterolů ovlivňuje vlastnosti plazmatické membrány, jako je fluidita (Abe a Hiraki 2009) a typy deformací (Bacia et al. 2005; Dupont et al. 2011). Tyto modifikace membránových vlastností vedly k prasknutí plazmatické membrány a buněčné smrti během hyperosmotického stresu u kmene erg6Δ, ale ne u WT (Dupont et al. 2011). Vztah mezi povahou převládajícího sterolu a vlastnostmi membrány je založen na struktuře molekuly sterolu, včetně jeho planární struktury, velikosti a vlastností jeho malé polární 3-OH skupiny (Xu a London 2000). Zejména je známo, že dvojná vazba C-7,8 sterolového kruhu B, která je přítomna pouze u kmenů erg5Δ, erg4Δ a WT (obr. 1B), se podílí na balení a celkové tuhosti plazmatické membrány (Xu a London 2000; Bakht a London 2006). Evoluce chemické struktury sterolů v EBP by tedy mohla jednak zlepšit antioxidační a mechanickou stabilizační roli těchto molekul v plazmatické membráně, jednak vysvětlit postupné zvyšování odolnosti kmenů kvasinek vůči vysychání/vlhnutí podél EBP.

V klasických laboratorních podmínkách nemá povaha sterolů žádný vliv na růst kvasinek. Kmeny WT a ergΔ skutečně rostly na plném médiu se stejnou kinetikou (údaje nejsou uvedeny). Akumulace jiných sterolů (cholesterolu, desmosterolu nebo kampesterolu) kvasinkami vyvolaná genetickou transformací nemá na růst buněk vliv (Souza et al. 2011). Povaha sterolů je tedy pro buňky ve stresových podmínkách klíčová. Skutečnost, že postup po EBP zvyšuje odolnost kvasinek vůči vysychání/vlhnutí, zakládá potenciální souvislost mezi touto dráhou a schopností hub přežívat v mezifázových stanovištích. Tento výsledek má důležité důsledky pro Blochovu hypotézu, která je založena na pozorování, že sterolové dráhy probíhají paralelně s vývojem sterolů a že produkt každého kroku by měl lépe podporovat buněčné a fyziologické funkce než jeho prekurzory (Bloch 1983). Tato hypotéza, která byla testována především pro strukturní funkci sterolů, však nikdy nebyla podpořena experimentálními fakty. Například v případě cholesterolové dráhy bylo prokázáno, že některé prekurzory jsou pro stabilizaci raftů v modelové membráně účinnější než cholesterol (Bakht a London 2006). Zapojení ergosterolu do odolnosti kvasinek vůči vysychání/vlhnutí by mohlo stát na počátku evoluce EBP a široké přítomnosti ergosterolu u suchozemských hub (Weete et al. 2010). Evoluce chemické struktury sterolů v EBP totiž mohla jednak zlepšit antioxidační a mechanickou stabilizační roli těchto molekul v plazmatické membráně, jednak vysvětlit postupné zvyšování odolnosti kvasinkových kmenů vůči vysychání/vlhnutí podél EBP. Tato studie, provedená v buněčném kontextu, poskytuje první experimentální údaje podporující Blochovu hypotézu.

I přes hlavní roli, kterou ergosterol zřejmě hraje při přetrvávání kvasinek v jejich přirozeném prostředí, Weete a kol. zabývající se otázkou diverzity sterolů u hub ukázali, že ergosterol není jediným sterolem v této říši (Weete a kol. 2010). Výsledky této studie podporují myšlenku, že cholesterol lze považovat za nejprimitivnější houbový sterol a že evoluce specifické struktury ergosterolu byla vedena funkčními požadavky specifickými pro vyvíjející se houby. Primitivní houby, které hromadí cholesterol, jsou totiž bičíkovci a žijí ve vodním prostředí (James et al. 2006; Weete et al. 2010), kde je hydratace maximální a stabilní. To je v souladu se skutečností, že cholesterol je účinným mechanickým stabilizátorem (Bakht a London 2006); ačkoli je jako antioxidant méně účinný než ergosterol (Wiseman 1993) (cholesterol má pouze jednu dvojnou vazbu v B-kruhu), jeho výroba je energeticky méně nákladná (Parks a Casey 1995). Tyto údaje v kombinaci s výsledky této studie by mohly znamenat, že syntéza ergosterolu poskytuje důležitou výhodu pro přežití vyšších hub a kolonizaci meziprostoru pevných látek a vzduchu.

Dospěli jsme k závěru, že přežití vysychání a vlhnutí je u kvasinek, jednobuněčných eukaryot neschopných udržovat homeostázu vody, usnadněno ergosterolem. Tato základní složka, specifická pro membrány hub, zvyšuje odolnost vůči mechanickým omezením a oxidaci způsobené odpařováním vody a přímým působením atmosférického vzduchu. Evoluce EBP proto mohla být klíčovým prvkem při dobývání meziprostoru pevného a vzdušného prostředí houbami. Výsledky této studie naznačují odpověď na věčnou otázku „proč ergosterol u hub?“. (Parks a Casey 1995). Mechanismy související s těmito zjištěními by měly být prohloubeny v budoucích experimentech. Za tímto účelem v současné době studujeme molekulární vlastnosti ergosterolu v plazmatické membráně, abychom objasnili mechanismy, kterými ergosterol chrání membránu před chemickými a fyzikálními změnami způsobenými vysoušením a zvlhčováním na vzduchu. Očekávané aplikace zahrnují optimalizaci metod založených na sušení pro konzervaci eukaryotických buněk a vývoj nových strategií pro ničení hub, které se podílejí na mnoha patogenních činnostech a kažení potravin.