Discusión
Los resultados de este estudio demuestran por primera vez el papel clave de la síntesis del ergosterol en la resistencia de las levaduras a los tratamientos de secado/humedecimiento (Fig. 2). La sustitución del zimosterol, el primer esterol de la EBP que se ensayó en este estudio (cepa erg6Δ), por ergosterol permitió restaurar la resistencia al nivel observado con la cepa WT (Tabla 2). Las principales transformaciones químicas que se producen durante el proceso biosintético de zimosterol a ergosterol son un cambio en la saturación del anillo B y de la cola alifática (Fig. 1B). Estas modificaciones graduales podrían contribuir a la optimización de las propiedades biofísicas de las moléculas en los pasos sucesivos a lo largo del PEB y podrían explicar el aumento de la resistencia a los ciclos de secado/humedecimiento. Nuestros resultados muestran que los tres primeros mutantes analizados (erg6Δ, erg2Δ y erg3Δ) son muy sensibles al secado/humedecimiento. La primera ruptura en el aumento de la resistencia a lo largo del EBP se detectó con la cepa erg5Δ. Ésta aumentó progresivamente con la cepa erg4Δ hasta alcanzar un valor máximo con la cepa WT (Fig. 2). Las estructuras químicas de los principales esteroles acumulados por estas tres últimas cepas se caracterizan por la presencia de dos dobles enlaces en el anillo B (Fig. 1B). Durante un ataque radical, estos dobles enlaces conjugados permiten la estabilización de los radicales de esterol por resonancia (deslocalización del electrón no apareado). Esta característica química podría explicar el efecto beneficioso sobre la supervivencia a la desecación/humectación, que implica la oxidación (Garre et al. 2010), al proteger los fosfolípidos contra la peroxidación de la misma manera que la vitamina E (Packer 1991). Los principales esteroles acumulados por las tres cepas con mutaciones tempranas en el EBP poseen un doble enlace C-C único en la posición C-7,8 o C-8,9, lejos del grupo hidroxilo, que no promueve la estabilización del radical por resonancia. Esto podría explicar la alta sensibilidad de las cepas erg6Δ, erg2Δ y erg3Δ al secado bajo aire atmosférico. El aumento progresivo de la resistencia hacia el final del EBP (Fig. 2), observado con las cepas erg5Δ, erg4Δ y WT, podría estar relacionado con la diferencia entre las colas alifáticas de los esteroles (Fig. 1B). De hecho, la estructura de la cola afecta a la planaridad de los esteroles, que es determinante para su posición en la membrana (Xu y London 2000; Bakht y London 2006). Así, los pasos finales de la vía del ergosterol podrían permitir un mejor ajuste del esterol en la membrana, modificando parámetros como su profundidad dentro de la bicapa lipídica, para optimizar la protección de los fosfolípidos frente a la oxidación. La protección de los lípidos contra la oxidación mediada por los esteroles ya se ha demostrado en membranas modelo (Wiseman 1993), pero nunca se ha demostrado en células biológicas. Nuestros resultados muestran, por primera vez, una relación entre la naturaleza de los esteroles y la resistencia a la oxidación. También apoyan una hipótesis que proponía que los esteroles podrían haber dado a las células resistencia a la oxidación cuando los niveles de oxígeno aumentaron durante la oxigenación de la Tierra (Galea y Brown 2009; Brown y Galea 2010). De hecho, los autores de este estudio concluyen que la síntesis de esteroles, un proceso dependiente del oxígeno (Fig. 1A), podría haber sido una respuesta adaptativa al aumento del oxígeno terrestre.
Los experimentos de secado realizados bajo nitrógeno dieron lugar a mayores tasas de supervivencia que los experimentos de secado al aire para todas las cepas analizadas (Fig. 2). El efecto de la ausencia de oxígeno durante el secado fue fuerte para las cepas con mutaciones en componentes tempranos del EBP, disminuyó para aquellas con mutaciones en componentes posteriores del EBP, y fue menor para la cepa WT. Estos resultados muestran que la oxidación desempeña un papel importante en el efecto letal del secado en condiciones atmosféricas. Sin embargo, dado que la tasa de mortalidad siguió siendo sustancial para las cepas erg6Δ, erg2Δ, erg3Δ y erg5Δ cuando el secado se realizó bajo nitrógeno, concluimos que otros factores distintos de la oxidación contribuyen a la muerte celular durante el secado. Uno de estos factores podría ser las severas restricciones mecánicas en la membrana plasmática resultantes de la pérdida de agua de las células por transferencia osmótica (Dupont et al. 2010). De hecho, se sabe que la naturaleza de los esteroles influye en las propiedades de la membrana plasmática, como la fluidez (Abe y Hiraki 2009) y los tipos de deformación (Bacia et al. 2005; Dupont et al. 2011). Estas modificaciones de las propiedades de la membrana condujeron a la ruptura de la membrana plasmática y a la muerte celular durante el estrés hiperosmótico en la cepa erg6Δ pero no en la WT (Dupont et al. 2011). La relación entre la naturaleza del esterol predominante y las propiedades de la membrana se basa en la estructura de la molécula de esterol, incluyendo su estructura planar, tamaño y propiedades de su pequeño grupo polar 3-OH (Xu y London 2000). En particular, se sabe que el doble enlace C-7,8 del anillo B del esterol, sólo presente en las cepas erg5Δ, erg4Δ y WT (Fig. 1B), está implicado en el empaquetamiento y la rigidez general de la membrana plasmática (Xu y London 2000; Bakht y London 2006). Por lo tanto, la evolución de la estructura química de los esteroles en la EBP podría tanto mejorar las funciones antioxidantes y estabilizadoras mecánicas de estas moléculas en la membrana plasmática como explicar el aumento progresivo a lo largo de la EBP de la resistencia de las cepas de levadura a la desecación/humectación.
En condiciones clásicas de laboratorio, la naturaleza de los esteroles no tiene ningún efecto sobre el crecimiento de la levadura. De hecho, las cepas WT y ergΔ crecieron con la misma cinética en medios completos (datos no mostrados). La acumulación de otros esteroles (colesterol, desmosterol o campesterol) por las levaduras, inducida por transformación genética, no afecta al crecimiento celular (Souza et al. 2011). Así, la naturaleza de los esteroles es crucial para las células en condiciones de estrés. El hecho de que la progresión hacia abajo del EBP aumente la resistencia de las levaduras a los eventos de secado/humedecimiento establece un vínculo potencial entre esta vía y la capacidad de los hongos para sobrevivir en hábitats interfaciales. Este resultado tiene importantes implicaciones para la hipótesis de Bloch, que se basa en la observación de que las vías de los esteroles son paralelas a la evolución de los mismos y que el producto de cada paso debería apoyar mejor las funciones celulares y fisiológicas que sus precursores (Bloch 1983). Sin embargo, esta hipótesis, que se ha comprobado principalmente en relación con la función estructural de los esteroles, nunca se ha visto respaldada por hechos experimentales. Por ejemplo, en la vía del colesterol, se ha demostrado que algunos precursores son más eficaces que el colesterol para la estabilización de la balsa en una membrana modelo (Bakht y London 2006). La implicación del ergosterol en la resistencia de las levaduras a los eventos de secado/humedecimiento podría estar en el origen de la evolución del EBP y de la presencia generalizada del ergosterol en los hongos terrestres (Weete et al. 2010). De hecho, la evolución de la estructura química de los esteroles en la EBP podría haber mejorado el papel antioxidante y estabilizador mecánico de estas moléculas en la membrana plasmática y explicar el aumento progresivo a lo largo de la EBP de la resistencia de las cepas de levadura a la desecación/humectación. Este estudio, realizado en un contexto celular, proporciona los primeros datos experimentales que apoyan la hipótesis de Bloch.
A pesar del importante papel que parece desempeñar el ergosterol en la persistencia de las levaduras en su entorno natural, Weete et al., que abordaron la cuestión de la diversidad de esteroles en los hongos, demostraron que el ergosterol no es el único esterol en este reino (Weete et al. 2010). Los resultados de este estudio apoyan la idea de que el colesterol puede considerarse el esterol fúngico más primitivo, y que la evolución de la estructura específica del ergosterol fue impulsada por requisitos funcionales específicos de los hongos en evolución. De hecho, los hongos primitivos que acumulan colesterol son flagelados y viven en un medio acuático (James et al. 2006; Weete et al. 2010) donde la hidratación es máxima y estable. Esto es consistente con el hecho de que el colesterol es un eficiente estabilizador mecánico (Bakht y London 2006); aunque es menos efectivo como antioxidante que el ergosterol (Wiseman 1993) (el colesterol posee sólo un doble enlace en el anillo B), es menos costoso energéticamente de producir (Parks y Casey 1995). Estos datos, unidos a los resultados del presente estudio, podrían significar que la síntesis de ergosterol confiere una importante ventaja para la supervivencia de los hongos superiores y la colonización de los hábitats interfaciales sólido-aire.
Concluimos que la supervivencia a la desecación y humectación se ve facilitada en la levadura, un eucariota unicelular incapaz de mantener la homeostasis del agua, por el ergosterol. Este componente esencial, específico de las membranas de los hongos, aumenta la resistencia a las restricciones mecánicas y a la oxidación causada por la evaporación del agua y la exposición directa al aire atmosférico. Por tanto, la evolución del EBP puede haber sido un elemento clave en la conquista de los hábitats interfaciales sólido-aire por parte de los hongos. Los resultados de este estudio sugieren una respuesta a la eterna pregunta «¿por qué el ergosterol en los hongos?» (Parks y Casey 1995). Los mecanismos relacionados con estos hallazgos deberán ser profundizados en futuros experimentos. Para ello, actualmente estamos estudiando las propiedades moleculares del ergosterol en la membrana plasmática para dilucidar los mecanismos por los que el ergosterol preserva la membrana de las alteraciones químicas y físicas causadas por el secado y la humectación del aire. Las aplicaciones previstas incluyen la optimización de métodos basados en el secado para la conservación de células eucariotas y el desarrollo de estrategias novedosas para la destrucción de hongos implicados en muchas actividades patógenas y de deterioro de los alimentos.