Diskussion
Resultaten av denna studie visar för första gången att ergosterolsyntesen spelar en nyckelroll i jästers motståndskraft mot torkning/fuktning (Fig. 2). Ersättning av zymosterol, den tidigaste sterolen i EBP som testades i denna studie (erg6Δ-stam), med ergosterol gjorde det möjligt att återställa resistensen till den nivå som observerades med WT-stammen (tabell 2). De viktigaste kemiska omvandlingarna som sker under biosyntesen från zymosterol till ergosterol är en förändring av B-ringens och den alifatiska svansens mättnad (fig. 1B). Dessa gradvisa förändringar skulle kunna bidra till en optimering av molekylernas biofysiska egenskaper vid efterföljande steg längs EBP och skulle kunna förklara den ökade motståndskraften mot torknings- och vätningscykler. Våra resultat visar att de tre tidigaste mutanterna som testades (erg6Δ, erg2Δ och erg3Δ) är mycket känsliga för torkning/vätning. Det första avbrottet i ökningen av motståndskraften längs EBP upptäcktes med erg5Δ-stammen. Den ökade successivt med erg4Δ för att nå ett maximalt värde med WT-stammen (fig. 2). De kemiska strukturerna hos de viktigaste sterolerna som ackumuleras av dessa tre sista stammar kännetecknas av förekomsten av två dubbelbindningar i B-ringen (fig. 1B). Vid en radikalattack möjliggör dessa konjugerade dubbelbindningar en stabilisering av sterolradikalerna genom resonans (delokalisering av den oparade elektronen). Denna kemiska egenskap skulle kunna förklara den gynnsamma effekten på överlevnaden vid torkning/fuktning, som inbegriper oxidation (Garre et al. 2010), genom att fosfolipiderna skyddas mot peroxidation på samma sätt som E-vitamin (Packer 1991). De viktigaste sterolerna som ackumuleras av de tre stammarna med mutationer tidigt i EBP har en unik dubbel C-C-bindning i positionen C-7,8 eller C-8,9, långt från hydroxylgruppen, vilket inte främjar radikalens stabilisering genom resonans. Detta skulle kunna förklara den höga känsligheten hos erg6Δ-, erg2Δ- och erg3Δ-stammarna för torkning i atmosfärisk luft. Den progressiva ökningen av motståndet mot slutet av EBP (fig. 2), som observerades hos erg5Δ-, erg4Δ- och WT-stammarna, kan vara relaterad till skillnaden mellan sterolernas alifatiska svansar (fig. 1B). Svansstrukturen påverkar faktiskt sterolernas planaritet, vilket är avgörande för deras position i membranet (Xu och London 2000; Bakht och London 2006). De sista stegen i ergosterolvägen kan således möjliggöra en bättre anpassning av sterolen i membranet, vilket ändrar parametrar som deras djup i lipiddubbelskiktet, för att optimera fosfolipidernas skydd mot oxidation. Det sterolmedierade skyddet av lipider mot oxidation har redan visats på modellmembran (Wiseman 1993) men har aldrig visats på biologiska celler. Våra resultat visar för första gången ett samband mellan sterolernas karaktär och motståndskraften mot oxidation. De stöder också en hypotes som föreslog att steroler kan ha gett cellerna motståndskraft mot oxidation när syrehalten steg under jordens syresättning (Galea och Brown 2009; Brown och Galea 2010). Författarna till den här studien drar faktiskt slutsatsen att syntesen av steroler, en syreberoende process (fig. 1A), kan ha varit ett adaptivt svar på ökningen av jordens syrehalt.
Torkningsexperiment utförda under kväve ledde till högre överlevnadsgrad än lufttorkningsexperiment för alla testade stammar (fig. 2). Effekten av syrebrist under torkning var stark för stammarna med mutationer i tidiga komponenter i EBP, minskade för dem med mutationer i senare komponenter i EBP och var liten för WT-stammen. Dessa resultat visar att oxidation spelar en viktig roll för den dödliga effekten av torkning under atmosfäriska förhållanden. Eftersom dödligheten förblev betydande för erg6Δ, erg2Δ, erg3Δ och erg5Δ när torkningen utfördes under kväve, drar vi dock slutsatsen att andra faktorer än oxidation bidrar till celldöd under torkning. En av dessa faktorer kan vara allvarliga mekaniska begränsningar på plasmamembranet till följd av vattenförlust från cellerna genom osmotisk överföring (Dupont et al. 2010). Det är faktiskt känt att sterolernas karaktär påverkar plasmamembranens egenskaper, t.ex. fluiditet (Abe och Hiraki 2009) och typer av deformation (Bacia et al. 2005; Dupont et al. 2011). Dessa modifieringar av membranegenskaperna ledde till plasmamembranruptur och celldöd under hyperosmotisk stress hos erg6Δ-stammen men inte hos WT-stammen (Dupont et al. 2011). Förhållandet mellan arten av den dominerande sterolen och membranegenskaperna bygger på sterolmolekylens struktur, inklusive dess plana struktur, storlek och egenskaper hos dess lilla polära 3-OH-grupp (Xu och London 2000). I synnerhet är det känt att C-7,8-dubbelbindningen i sterolens B-ring, som endast finns i erg5Δ-, erg4Δ- och WT-stammarna (fig. 1B), är involverad i plasmamembranets packning och övergripande styvhet (Xu och London 2000; Bakht och London 2006). Utvecklingen av sterolernas kemiska struktur i EBP kan således både förbättra dessa molekylers roll som antioxidanter och mekaniska stabilisatorer i plasmamembranet och förklara den progressiva ökningen längs EBP av jäststammarnas motståndskraft mot torkning/vätning.
Under klassiska laboratorieförhållanden har sterolernas beskaffenhet ingen effekt på jästtillväxten. WT- och ergΔ-stammarna växte faktiskt med samma kinetik på fullmedia (data visas inte). Ackumulering av andra steroler (kolesterol, desmosterol eller campesterol) i jäst, inducerad genom genetisk transformation, påverkar inte celltillväxten (Souza et al. 2011). Sterolernas karaktär är således avgörande för celler under stressförhållanden. Det faktum att progression nedåt i EBP ökar jästens motståndskraft mot torkning/vätning etablerar en potentiell koppling mellan denna väg och svamparnas förmåga att överleva i gränsytor. Detta resultat har viktiga implikationer för Bloch-hypotesen, som bygger på observationen att sterolvägarna är parallella med sterolevolutionen och att produkten av varje steg bättre bör stödja cellulära och fysiologiska funktioner än dess föregångare (Bloch 1983). Denna hypotes, som huvudsakligen har testats för sterolernas strukturella funktion, har dock aldrig fått stöd av experimentella fakta. I kolesterolvägen har det till exempel visats att vissa prekursorer är effektivare än kolesterol för flottstabilisering i ett modellmembran (Bakht och London 2006). Ergosterols inblandning i jästens motståndskraft mot torknings-/nätningshändelser skulle kunna ligga till grund för utvecklingen av EBP och den utbredda förekomsten av ergosterol i marksvampar (Weete et al. 2010). Utvecklingen av sterolernas kemiska struktur i EBP kan ha förbättrat dessa molekylers roll som antioxidanter och mekaniska stabilisatorer i plasmamembranet och förklara den progressiva ökningen längs EBP av jäststammarnas motståndskraft mot torkning/vätning. Denna studie, som utfördes i ett cellulärt sammanhang, ger de första experimentella data som stöder Bloch-hypotesen.
Trots den stora roll som ergosterol tycks spela för jästers fortlevnad i deras naturliga miljö, visade Weete et al. som behandlade frågan om sterolernas mångfald i svampar att ergosterol inte är den enda sterolen i detta rike (Weete et al. 2010). Resultaten av den här studien stöder idén att kolesterol kan betraktas som den mest primitiva svampsterolen och att evolutionen av ergosterolens specifika struktur drevs av funktionella krav som är specifika för evolverande svampar. De primitiva svampar som ackumulerar kolesterol är faktiskt flagellerade och lever i ett akvatiskt medium (James et al. 2006; Weete et al. 2010) där hydreringen är maximal och stabil. Detta stämmer överens med det faktum att kolesterol är en effektiv mekanisk stabilisator (Bakht och London 2006); även om det är mindre effektivt som antioxidant än ergosterol (Wiseman 1993) (kolesterol har endast en dubbelbindning i B-ringen), är det mindre energetiskt dyrt att producera (Parks och Casey 1995). Dessa uppgifter, tillsammans med resultaten av denna studie, skulle kunna innebära att syntesen av ergosterol ger en viktig fördel för högre svampars överlevnad och kolonisering av livsmiljöer i gränsytor mellan fast och luft.
Vi drar slutsatsen att överlevnad av torkning och vätning underlättas i jäst, en encellig eukaryot som inte kan upprätthålla vattenhomeostas, av ergosterol. Denna viktiga komponent, som är specifik för svamparnas membran, ökar motståndskraften mot mekaniska begränsningar och oxidation som orsakas av vattenavdunstning och direkt exponering för atmosfärisk luft. Därför kan utvecklingen av EBP ha varit en nyckelfaktor i svamparnas erövring av livsmiljöer i gränsytan mellan fast och luft. Resultaten av denna studie ger ett svar på den ständiga frågan ”varför ergosterol hos svampar?”. (Parks och Casey 1995). De mekanismer som är kopplade till dessa resultat bör fördjupas i framtida experiment. I detta syfte studerar vi för närvarande ergosterols molekylära egenskaper i plasmamembranet för att belysa de mekanismer genom vilka ergosterol bevarar membranet från kemiska och fysiska förändringar som orsakas av lufttorkning och vätning. De förväntade tillämpningarna omfattar optimering av torkningsbaserade metoder för bevarande av eukaryota celler och utveckling av nya strategier för destruktion av svampar som är inblandade i många patogena och livsmedelsförstörande aktiviteter.