Discuție

Rezultatele acestui studiu demonstrează pentru prima dată rolul cheie al sintezei de ergosterol în rezistența drojdiilor la tratamentele de uscare/umectare (Fig. 2). Înlocuirea zymosterolului, cel mai timpuriu sterol al EBP care a fost testat în acest studiu (tulpina erg6Δ), cu ergosterol a permis restabilirea rezistenței la nivelul observat la tulpina WT (tabelul 2). Principalele transformări chimice care au loc în timpul procesului de biosinteză de la zymosterol la ergosterol sunt o modificare a saturației inelului B și a cozii alifatice (Fig. 1B). Aceste modificări treptate ar putea contribui la optimizarea proprietăților biofizice ale moleculelor în etapele succesive de-a lungul EBP și ar putea explica creșterea rezistenței la ciclurile de uscare/umectare. Rezultatele noastre arată că cei trei primii trei mutanți testați (erg6Δ, erg2Δ și erg3Δ) sunt foarte sensibili la uscare/umectare. Prima întrerupere a creșterii rezistenței de-a lungul EBP a fost detectată în cazul tulpinii erg5Δ. Aceasta a crescut progresiv cu erg4Δ pentru a atinge o valoare maximă cu tulpina WT (Fig. 2). Structurile chimice ale principalilor steroli acumulați de aceste ultime trei tulpini sunt caracterizate de prezența a două legături duble în inelul B (Fig. 1B). În timpul unui atac radicalic, aceste duble legături conjugate permit stabilizarea radicalilor de steroli prin rezonanță (delocalizarea electronului nepereche). Această caracteristică chimică ar putea explica efectul benefic asupra supraviețuirii la uscare/umectare, care implică oxidarea (Garre et al. 2010), prin protejarea fosfolipidelor împotriva peroxidării în același mod ca și vitamina E (Packer 1991). Principalii steroli acumulați de cele trei tulpini cu mutații la începutul EBP posedă o legătură dublă C-C unică în poziția C-7,8 sau C-8,9, departe de grupul hidroxil, care nu favorizează stabilizarea radicalului prin rezonanță. Acest lucru ar putea explica sensibilitatea ridicată a tulpinilor erg6Δ, erg2Δ și erg3Δ la uscarea în aer atmosferic. Creșterea progresivă a rezistenței spre sfârșitul EBP (Fig. 2), observată la tulpinile erg5Δ, erg4Δ și WT, ar putea fi legată de diferența dintre cozile alifatice ale sterolilor (Fig. 1B). Într-adevăr, structura cozii afectează planaritatea sterolilor, care este un factor determinant al poziției lor în membrană (Xu și London 2000; Bakht și London 2006). Astfel, etapele finale ale căii ergosterolului ar putea permite o mai bună încadrare a sterolului în membrană, modificând parametrii, cum ar fi adâncimea lor în bistratul lipidic, pentru a optimiza protecția fosfolipidelor împotriva oxidării. Protecția mediată de steroli a lipidelor împotriva oxidării a fost deja demonstrată pe membrane model (Wiseman 1993), dar nu a fost niciodată demonstrată pe celule biologice. Rezultatele noastre arată, pentru prima dată, o relație între natura sterolilor și rezistența la oxidare. De asemenea, ele susțin o ipoteză care propunea că sterolii ar fi putut conferi celulelor rezistență la oxidare atunci când nivelurile de oxigen au crescut în timpul oxigenării Pământului (Galea și Brown 2009; Brown și Galea 2010). Într-adevăr, autorii acestui studiu concluzionează că sinteza de steroli, un proces dependent de oxigen (Fig. 1A), ar fi putut fi un răspuns adaptativ la creșterea nivelului de oxigen terestru.

Experimentele de uscare efectuate sub azot au condus la rate de supraviețuire mai mari decât experimentele de uscare în aer pentru toate tulpinile testate (Fig. 2). Efectul absenței oxigenului în timpul uscării a fost puternic pentru tulpinile cu mutații în componentele timpurii ale EBP, a scăzut pentru cele cu mutații în componentele ulterioare ale EBP și a fost minor pentru tulpina WT. Aceste rezultate arată că oxidarea joacă un rol major în efectul letal al uscării în condiții atmosferice. Cu toate acestea, deoarece rata de mortalitate a rămas substanțială pentru erg6Δ, erg2Δ, erg3Δ și erg5Δ atunci când uscarea a fost efectuată în condiții de azot, concluzionăm că alți factori decât oxidarea contribuie la moartea celulelor în timpul uscării. Unul dintre acești factori ar putea fi constrângerile mecanice severe asupra membranei plasmatice care rezultă din pierderea apei din celule prin transfer osmotic (Dupont et al. 2010). Într-adevăr, se știe că natura sterolilor influențează proprietățile membranei plasmatice, cum ar fi fluiditatea (Abe și Hiraki 2009) și tipurile de deformare (Bacia și colab. 2005; Dupont și colab. 2011). Aceste modificări ale proprietăților membranei au condus la ruperea membranei plasmatice și la moartea celulelor în timpul stresului hiperosmotic la tulpina erg6Δ, dar nu și la WT (Dupont et al. 2011). Relația dintre natura sterolului predominant și proprietățile membranei se bazează pe structura moleculei de sterol, inclusiv structura sa plană, dimensiunea și proprietățile micului său grup polar 3-OH (Xu și London 2000). În special, se știe că dubla legătură C-7,8 a inelului B al sterolului, prezentă doar în tulpinile erg5Δ, erg4Δ și WT (Fig. 1B), este implicată în împachetarea și rigiditatea generală a membranei plasmatice (Xu și London 2000; Bakht și London 2006). Astfel, evoluția structurii chimice a sterolilor în EBP ar putea atât să îmbunătățească rolul antioxidant și stabilizator mecanic al acestor molecule în membrana plasmatică, cât și să explice creșterea progresivă de-a lungul EBP a rezistenței tulpinilor de drojdie la uscare/umectare.

În condiții clasice de laborator, natura sterolilor nu are niciun efect asupra creșterii drojdiei. Într-adevăr, tulpinile WT și ergΔ au crescut cu aceeași cinetică pe medii complete (datele nu sunt prezentate). Acumularea altor steroli (colesterol, desmosterol sau campesterol) de către drojdii, indusă prin transformare genetică, nu afectează creșterea celulară (Souza et al. 2011). Astfel, natura sterolilor este crucială pentru celulele aflate în condiții de stres. Faptul că progresia în jos a EBP crește rezistența drojdiei la evenimentele de uscare/umectare stabilește o legătură potențială între această cale și capacitatea ciupercilor de a supraviețui în habitatele interfaciale. Acest rezultat are implicații importante pentru ipoteza Bloch, care se bazează pe observația conform căreia căile sterolilor sunt paralele cu evoluția sterolilor și că produsul fiecărei etape ar trebui să susțină mai bine funcțiile celulare și fiziologice decât precursorii săi (Bloch 1983). Cu toate acestea, această ipoteză, care a fost testată în principal pentru funcția structurală a sterolilor, nu a fost niciodată susținută de fapte experimentale. De exemplu, în calea colesterolului, s-a demonstrat că unii precursori sunt mai eficienți decât colesterolul pentru stabilizarea rafturilor într-o membrană model (Bakht și London 2006). Implicarea ergosterolului în rezistența drojdiei la evenimentele de uscare/umectare ar putea fi la originea evoluției EBP și a prezenței răspândite a ergosterolului în ciupercile terestre (Weete et al. 2010). Într-adevăr, evoluția structurii chimice a sterolilor în EBP ar fi putut atât să îmbunătățească rolul antioxidant și stabilizator mecanic al acestor molecule în membrana plasmatică, cât și să explice creșterea progresivă de-a lungul EBP a rezistenței tulpinilor de drojdie la uscare/umectare. Acest studiu, realizat într-un context celular, oferă primele date experimentale care susțin ipoteza Bloch.

În ciuda rolului major pe care ergosterolul pare să îl joace în persistența drojdiilor în mediul lor natural, Weete și colab. care au abordat problema diversității sterolilor în ciuperci, au arătat că ergosterolul nu este singurul sterol din acest regn (Weete și colab. 2010). Rezultatele acestui studiu susțin ideea că colesterolul poate fi considerat cel mai primitiv sterol fungic și că evoluția structurii specifice a ergosterolului a fost determinată de cerințele funcționale specifice ciupercilor în evoluție. Într-adevăr, ciupercile primitive care acumulează colesterol sunt flagelate și trăiesc într-un mediu acvatic (James et al. 2006; Weete et al. 2010), unde hidratarea este maximă și stabilă. Acest lucru este în concordanță cu faptul că colesterolul este un stabilizator mecanic eficient (Bakht și London 2006); deși este mai puțin eficient ca antioxidant decât ergosterolul (Wiseman 1993) (colesterolul posedă doar o singură legătură dublă în inelul B), este mai puțin costisitor din punct de vedere energetic pentru a fi produs (Parks și Casey 1995). Aceste date, coroborate cu rezultatele studiului de față, ar putea însemna că sinteza ergosterolului conferă un avantaj important pentru supraviețuirea ciupercilor superioare și pentru colonizarea habitatelor interfaciale solid-aer.

Concluzionăm că supraviețuirea la uscare și umezire este facilitată la drojdie, un eucariot unicelular incapabil să mențină homeostazia apei, de către ergosterol. Această componentă esențială, specifică membranelor ciupercilor, crește rezistența la constrângerile mecanice și la oxidarea cauzată de evaporarea apei și de expunerea directă la aerul atmosferic. Prin urmare, este posibil ca evoluția EBP să fi fost un element-cheie în cucerirea de către ciuperci a habitatelor interfaciale solid-aer. Rezultatele acestui studiu sugerează un răspuns la întrebarea permanentă „de ce ergosterol la ciuperci?”. (Parks și Casey 1995). Mecanismele legate de aceste constatări ar trebui aprofundate în experimente viitoare. În acest scop, studiem în prezent proprietățile moleculare ale ergosterolului în membrana plasmatică pentru a elucida mecanismele prin care ergosterolul conservă membrana de alterările chimice și fizice cauzate de uscarea și umezirea la aer. Aplicațiile preconizate includ optimizarea metodelor bazate pe uscare pentru conservarea celulelor eucariote și dezvoltarea de noi strategii pentru distrugerea ciupercilor implicate în numeroase activități patogene și de alterare a alimentelor.