Discussion
De resultaten van deze studie tonen voor de eerste keer de sleutelrol aan van de synthese van ergosterol in de weerstand van gisten tegen droog/nat behandelingen (Fig. 2). Vervanging van zymosterol, het vroegste sterol van het EBP dat in deze studie werd getest (stam erg6Δ), door ergosterol maakte het mogelijk de resistentie te herstellen tot het niveau dat werd waargenomen bij de WT-stam (Tabel 2). De belangrijkste chemische transformaties die tijdens het biosyntheseproces van zymosterol naar ergosterol plaatsvinden, zijn een verandering in de verzadiging van de B-ring en van de alifatische staart (Fig. 1B). Deze geleidelijke modificaties zouden kunnen bijdragen tot de optimalisatie van de biofysische eigenschappen van de moleculen in de opeenvolgende stappen van het EBP en zouden de toegenomen weerstand tegen droog/nat-cycli kunnen verklaren. Onze resultaten tonen aan dat de drie vroegst geteste mutanten (erg6Δ, erg2Δ en erg3Δ) zeer gevoelig zijn voor drogen/bevochtigen. De eerste onderbreking in de toename van de resistentie langs het EBP werd waargenomen bij de stam erg5Δ. Deze nam geleidelijk toe met erg4Δ om bij de WT-stam een maximale waarde te bereiken (fig. 2). De chemische structuren van de voornaamste sterolen die door deze laatste drie stammen worden geaccumuleerd, worden gekenmerkt door de aanwezigheid van twee dubbele bindingen in de B-ring (fig. 1B). Tijdens een radicale aanval maken deze geconjugeerde dubbele bindingen de stabilisatie van sterolradicalen mogelijk door resonantie (delokalisatie van het ongepaarde elektron). Deze chemische eigenschap zou een verklaring kunnen zijn voor het gunstige effect op de overleving bij drogen/bevochtigen, waarbij oxidatie optreedt (Garre et al. 2010), door de fosfolipiden op dezelfde wijze tegen peroxidatie te beschermen als vitamine E (Packer 1991). De belangrijkste sterolen die door de drie stammen met mutaties vroeg in het EBP worden geaccumuleerd, bezitten een unieke dubbele C-C-binding op de positie C-7,8 of C-8,9, ver van de hydroxylgroep, die de stabilisatie van de radicaal door resonantie niet bevordert. Dit zou een verklaring kunnen zijn voor de grote gevoeligheid van de stammen erg6Δ, erg2Δ en erg3Δ voor droging onder atmosferische lucht. De progressieve toename van de weerstand tegen het einde van het EBP (fig. 2), die bij de stammen erg5Δ, erg4Δ en WT wordt waargenomen, zou verband kunnen houden met het verschil tussen de alifatische staarten van de sterolen (fig. 1B). De staartstructuur beïnvloedt namelijk de planariteit van de sterolen, die bepalend is voor hun positie in het membraan (Xu en London 2000; Bakht en London 2006). De laatste stappen van de ergosterolroute zouden dus een betere plaatsing van de sterolen in het membraan mogelijk kunnen maken, waarbij parameters zoals hun diepte binnen de lipide bilaag worden gewijzigd, om de bescherming van fosfolipiden tegen oxidatie te optimaliseren. De sterol-gemedieerde bescherming van lipiden tegen oxidatie is reeds aangetoond op modelmembranen (Wiseman 1993), maar is nog nooit aangetoond op biologische cellen. Onze resultaten tonen voor het eerst een verband aan tussen de aard van de sterolen en de weerstand tegen oxidatie. Zij ondersteunen ook een hypothese die voorstelde dat sterolen de cellen weerstand tegen oxidatie kunnen hebben gegeven toen het zuurstofgehalte tijdens de aardse oxygenatie steeg (Galea en Brown 2009; Brown en Galea 2010). De auteurs van deze studie concluderen inderdaad dat de synthese van sterolen, een zuurstofafhankelijk proces (Fig. 1A), een adaptieve reactie zou kunnen zijn geweest op de stijging van het zuurstofgehalte op aarde.
Droogexperimenten uitgevoerd onder stikstof leidden tot hogere overlevingspercentages dan luchtdroogexperimenten voor alle geteste stammen (Fig. 2). Het effect van zuurstofgebrek tijdens het drogen was sterk voor de stammen met mutaties in vroege componenten van het EBP, verminderde voor die met mutaties in latere componenten van het EBP, en was gering voor de WT-stam. Deze resultaten tonen aan dat oxidatie een belangrijke rol speelt in het dodelijke effect van drogen onder atmosferische omstandigheden. Aangezien het sterftecijfer echter aanzienlijk bleef voor erg6Δ, erg2Δ, erg3Δ en erg5Δ wanneer het drogen werd uitgevoerd onder stikstof, concluderen wij dat andere factoren dan oxidatie bijdragen tot de celdood tijdens het drogen. Een van deze factoren zou ernstige mechanische druk op het plasmamembraan kunnen zijn als gevolg van waterverlies uit de cellen door osmotische overdracht (Dupont et al. 2010). Het is inderdaad bekend dat de aard van de sterolen de eigenschappen van de plasmamembraan beïnvloedt, zoals de vloeibaarheid (Abe en Hiraki 2009) en de soorten vervorming (Bacia et al. 2005; Dupont et al. 2011). Deze wijzigingen van membraaneigenschappen leidden tot breuk van de plasmamembraan en celdood tijdens hyperosmotische stress bij de erg6Δ stam, maar niet bij de WT (Dupont et al. 2011). De relatie tussen de aard van het overheersende sterol en de membraaneigenschappen is gebaseerd op de structuur van het sterolmolecuul, waaronder de vlakke structuur, de grootte en de eigenschappen van de kleine polaire 3-OH groep (Xu en London 2000). In het bijzonder is bekend dat de dubbele binding C-7,8 van de sterol B-ring, die alleen aanwezig is in de stammen erg5Δ, erg4Δ en WT (Fig. 1B), betrokken is bij de pakking en de algehele stijfheid van het plasmamembraan (Xu en London 2000; Bakht en London 2006). De evolutie van de chemische structuur van sterolen in het EBP zou dus zowel de antioxiderende als de mechanische stabiliserende rol van deze moleculen in het plasmamembraan kunnen verbeteren en de progressieve toename langs het EBP van de weerstand van giststammen tegen drogen/bevochtigen kunnen verklaren.
Onder klassieke laboratoriumomstandigheden heeft de aard van de sterolen geen effect op de groei van de gist. Inderdaad, de WT en ergΔ stammen groeiden met dezelfde kinetiek op volle media (gegevens niet getoond). Accumulatie van andere sterolen (cholesterol, desmosterol, of campesterol) door gisten, geïnduceerd door genetische transformatie, heeft geen invloed op de celgroei (Souza et al. 2011). De aard van de sterolen is dus van cruciaal belang voor cellen onder stressomstandigheden. Het feit dat de progressie in de EBP de weerstand van de gist tegen droog/nat gebeurtenissen verhoogt, legt een mogelijk verband tussen deze route en het vermogen van schimmels om te overleven in interfaciale habitats. Dit resultaat heeft belangrijke implicaties voor de Bloch-hypothese, die gebaseerd is op de waarneming dat sterol-paden parallel lopen met de evolutie van sterolen en dat het product van elke stap betere cellulaire en fysiologische functies zou moeten ondersteunen dan zijn precursors (Bloch 1983). Deze hypothese, die voornamelijk is getest voor de structurele functie van sterolen, is echter nooit door experimentele feiten ondersteund. Zo is in de cholesterolroute aangetoond dat sommige precursoren efficiënter zijn dan cholesterol voor de stabilisatie van vlotten in een modelmembraan (Bakht and London 2006). De betrokkenheid van ergosterol bij de resistentie van gist tegen droog/nat gebeurtenissen zou aan de oorsprong kunnen liggen van de evolutie van het EBP en van de wijdverspreide aanwezigheid van ergosterol in landschimmels (Weete et al. 2010). De evolutie van de chemische structuur van sterolen in het EBP zou immers zowel de antioxiderende als de mechanische stabiliserende rol van deze moleculen in het plasmamembraan kunnen hebben verbeterd en de progressieve toename langsheen het EBP van de weerstand van giststammen tegen uitdroging/bevochtiging kunnen verklaren. Deze studie, uitgevoerd in een cellulaire context, levert de eerste experimentele gegevens die de Bloch-hypothese ondersteunen.
Ondanks de belangrijke rol die ergosterol lijkt te spelen in de persistentie van gisten in hun natuurlijke omgeving, toonden Weete et al., die de kwestie van de diversiteit van sterolen in schimmels behandelden, aan dat ergosterol niet het enige sterol is in dit koninkrijk (Weete et al. 2010). De bevindingen van deze studie ondersteunen het idee dat cholesterol als het meest primitieve fungale sterol kan worden beschouwd, en dat de evolutie van de specifieke structuur van ergosterol werd aangedreven door functionele vereisten die specifiek zijn voor evoluerende fungi. De primitieve schimmels die cholesterol accumuleren zijn immers geflagelleerd en leven in een aquatisch medium (James et al. 2006; Weete et al. 2010) waar hydratatie maximaal en stabiel is. Dit strookt met het feit dat cholesterol een efficiënte mechanische stabilisator is (Bakht en London 2006); hoewel het minder doeltreffend is als antioxidant dan ergosterol (Wiseman 1993) (cholesterol bezit slechts één dubbele binding in de B-ring), is het energetisch minder duur om te produceren (Parks en Casey 1995). Deze gegevens, samengebracht met de resultaten van de huidige studie, zouden kunnen betekenen dat de synthese van ergosterol een belangrijk voordeel biedt voor de overleving van hogere schimmels en de kolonisatie van de vaste-lucht interfaciale habitats.
Wij concluderen dat het overleven van drogen en nat worden in gist, een eencellige eukaryoot die niet in staat is om water homeostase te handhaven, wordt vergemakkelijkt door ergosterol. Deze essentiële component, specifiek voor de membranen van schimmels, verhoogt de weerstand tegen mechanische beperkingen en oxidatie veroorzaakt door waterverdamping en directe blootstelling aan atmosferische lucht. De evolutie van het EBP kan dus een sleutelelement geweest zijn in de verovering van vaste-lucht interfaciale habitats door schimmels. De resultaten van deze studie suggereren een antwoord op de eeuwige vraag “waarom ergosterol bij schimmels?” (Parks and Casey 1995). De mechanismen die verband houden met deze bevindingen moeten in toekomstige experimenten verder worden uitgediept. Met dit doel bestuderen we momenteel de moleculaire eigenschappen van ergosterol in het plasmamembraan om de mechanismen op te helderen waardoor ergosterol het membraan vrijwaart van chemische en fysische veranderingen veroorzaakt door luchtdroging en bevochtiging. De verwachte toepassingen omvatten de optimalisering van op droging gebaseerde methoden voor de conservering van eukaryote cellen en de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor de vernietiging van schimmels die betrokken zijn bij veel pathogene en voedselbederf veroorzakende activiteiten.