Discussion

本研究の結果、酵母の乾燥・湿潤処理に対する抵抗性にエルゴステロールの合成が大きく関わることが初めて示された（図2）。 今回試験したEBP（erg6Δ株）の最古のステロールであるザイステロールをエルゴステロールに置換すると、WT株で観察されたレベルまで抵抗性を回復させることができた（表2）。 ジステロールからエルゴステロールへの生合成過程で起こる主な化学変化は、B環の飽和度の変化と脂肪族テールの変化である（Fig.1B）。 これらの漸進的な変化は、EBPの次のステップで分子の生物物理学的特性の最適化に貢献し、乾燥/湿潤サイクルに対する抵抗性の増加を説明することができるだろう。 我々の結果は、試験した3つの最も初期の変異体（erg6Δ、erg2Δ、erg3Δ）が乾燥/湿潤に対して非常に敏感であることを示している。 EBPに沿った抵抗の増加における最初のブレークは、erg5Δ株で検出された。 これはerg4ΔΔで徐々に増加し、WT株で最大値に達した(Fig. 2)。 これら3つの菌株が蓄積した主要なステロールの化学構造は、B環に2つの二重結合が存在することが特徴である（Fig.1B）。 ラジカル攻撃時には、これらの共役二重結合が共鳴（不対電子の非局在化）によりステロールラジカルを安定化させる。 この化学的特性は、ビタミンEと同様にリン脂質を過酸化物から保護することで、酸化を伴う乾燥・湿潤に対する生存率に有益な効果をもたらす（Garre et al. EBPの初期に変異を持つ3株が蓄積する主なステロールは、水酸基から離れたC-7,8またはC-8,9の位置に独特の二重C-C結合を持ち、これは共鳴によるラジカルの安定化を促進しない。 このことは、erg6Δ、erg2Δ、erg3Δ株が大気圧下の乾燥に対して高い感受性を持つことを説明することができる。 また、erg5ΔΔ株、erg4ΔΔ株、WT株で観察されたEBPの末端に向かって抵抗が増加する現象（図2）は、ステロールの脂肪族テールの違い（図1B）と関連している可能性がある。 実際、尾部の構造はステロールの平面性に影響を与え、膜内での位置を決定する要因となっている（Xu and London 2000; Bakht and London 2006）。 したがって、エルゴステロール経路の最終段階は、ステロールの膜への適合性を向上させ、脂質二重層内の深さなどのパラメータを変更し、リン脂質の酸化からの保護を最適化することができるかもしれない。 ステロールを介した酸化に対する脂質の保護は、すでにモデル膜で示されている（Wiseman 1993）が、生体細胞では実証されたことがない。 今回の結果は、ステロールの性質と酸化に対する抵抗性の関係を初めて示したものである。 また、地球の酸素供給時代に酸素濃度が上昇した際、ステロールが細胞に酸化耐性を与えたのではないかという仮説も支持されている（Galea and Brown 2009; Brown and Galea 2010）。 実際、この研究の著者らは、酸素に依存するプロセスであるステロールの合成（図1A）は、地上の酸素の増加に対する適応反応であった可能性があると結論づけている。

窒素下で行った乾燥実験では、試験したすべての株で空気乾燥実験よりも高い生存率が得られた（図2）。 乾燥中の酸素欠乏の影響はEBPの初期構成要素に変異を持つ株で強く、EBPの後期構成要素に変異を持つ株で減少し、WT株では軽微であった。 これらの結果は、大気圧条件下での乾燥の致死効果に酸化が大きく関与していることを示している。 しかし、erg6ΔΔ、erg2Δ、erg3Δ、erg5Δについては、窒素下で乾燥させても死滅率が大きく変わらないことから、乾燥中の細胞死には酸化以外の要因が寄与していると結論づけた。 これらの要因の1つは、浸透圧移動によって細胞から水分が失われた結果、細胞膜に対する厳しい機械的制約が生じる可能性がある（Dupont et al.2010）。 実際、ステロールの性質は、流動性（Abe and Hiraki 2009）や変形の種類（Bacia et al.2005; Dupont et al.2011）などの細胞膜の性質に影響を与えることが知られている。 これらの膜特性の変化は、erg6Δ株では高浸透圧ストレス時に細胞膜の破裂と細胞死を引き起こしたが、WT株では起こらなかった（Dupont et al.2011）。 優勢なステロールの性質と膜特性の関係は、ステロール分子の平面構造、大きさ、小さな極性3-OH基の性質などの構造に基づいている（Xu and London 2000）。 特に、erg5Δ、erg4Δ、WT株にのみ存在するステロールB環のC-7,8二重結合（図1B）は、細胞膜のパッキングと全体の剛性に関与していることが知られている（Xu and London 2000; Bakht and London 2006）。 したがって、EBPにおけるステロールの化学構造の進化は、細胞膜におけるこれらの分子の抗酸化剤および機械的安定化剤の役割を改善すると同時に、乾燥/湿潤に対する酵母株の抵抗性がEBPに沿って徐々に増加することを説明することができると思われる。

古典的な実験室条件下では、ステロールの性質は酵母の増殖に影響を与えない。 実際、WT株とergΔ株は完全培地上で同じ速度論で増殖した（データは示していない）。 遺伝子組換えによって誘導された酵母による他のステロール（コレステロール、デソステロール、またはカンペステロール）の蓄積は、細胞増殖に影響を与えない（Souza et al.2011）。 このように、ステロールの性質は、ストレス条件下における細胞にとって極めて重要である。 EBPを進行させると、乾燥/湿潤現象に対する酵母の耐性が高まるという事実は、この経路と菌類が界面生息地で生き残る能力との間に関連性がある可能性を立証している。 この結果は、ステロール経路はステロールの進化と並行しており、各ステップの生成物はその前駆体よりも細胞や生理機能をよりよくサポートするはずだという観察に基づいているBloch仮説（Bloch 1983）にとって重要な意味を持っている。 しかし、主にステロールの構造的機能について検証されてきたこの仮説は、実験的な事実によって支持されたことはない。 例えば、コレステロール経路では、いくつかの前駆体はコレステロールよりもモデル膜のラフト安定化に有効であることが示されている（Bakht and London 2006）。 酵母の乾燥・湿潤現象に対する耐性にエルゴステロールが関与していることは、EBPの進化と陸上菌にエルゴステロールが広く存在することの起源であると考えられる（Weete et al.2010）。 実際、EBPにおけるステロールの化学構造の進化は、細胞膜におけるこれらの分子の抗酸化剤および機械的安定化剤の役割を改善し、乾燥／湿潤に対する酵母株の抵抗性がEBPに沿って徐々に増加することを説明できたと思われる。 この研究は、細胞内で行われ、ブロッホ仮説を支持する最初の実験データを提供するものである。

酵母の自然環境での生存にエルゴステロールが大きな役割を果たしているようですが、菌類におけるステロールの多様性の問題に取り組んだWeeteらは、この王国ではエルゴステロールだけがステロールではないことを示しました（Weete et al.2010）。 本研究の結果は、コレステロールが最も原始的な真菌類のステロールと考えられ、エルゴステロールの特異的構造の進化は、進化する真菌類に特有の機能的要求によって引き起こされたという考えを支持するものである。 実際、コレステロールを蓄積する原始的な真菌は鞭毛を持ち、水和が最大かつ安定な水性培地に生息している（James et al. これは、コレステロールが効率的な機械的安定剤であること（Bakht and London 2006）、エルゴステロール（Wiseman 1993）よりも抗酸化剤としての効果は低いものの（コレステロールはB環に二重結合を1つしか持たない）、生産にかかるエネルギーが少ない（Parks and Casey 1995）ことと矛盾していない。 これらのデータと本研究の結果を合わせると、エルゴステロールの合成は、高等真菌の生存と固体-空気界面生息域のコロニー形成に重要な利点を与えることを意味する可能性がある。

水の恒常性を維持できない単細胞真核生物である酵母において、乾燥と湿潤の生存はエルゴステロールによって促進されると結論づけた。 この真菌の膜に特異的な必須成分は、水の蒸発や大気中の空気に直接さらされることによる機械的制約や酸化に対する抵抗力を高めている。 したがって、EBPの進化は、菌類が固体-空気界面の生息地を征服する上で重要な要素であった可能性がある。 本研究の結果は、”なぜ菌類にエルゴステロールが存在するのか？”という永続的な疑問に対する答えを示唆している。 (Parks and Casey 1995)。 これらの知見に関連するメカニズムについては、今後の実験で深めていく必要がある。 そのために、現在、細胞膜におけるエルゴステロールの分子的性質を調べ、エルゴステロールが風乾や湿潤による化学的・物理的変化から細胞膜を保護する機構を解明するための研究を行っている。 真核細胞の保存のための乾燥に基づく方法の最適化や、多くの病原性や食品腐敗に関与する真菌の破壊のための新しい戦略の開発などの応用が期待されます。