Discussione

I risultati di questo studio dimostrano per la prima volta il ruolo chiave della sintesi dell’ergosterolo nella resistenza dei lieviti ai trattamenti di essiccazione/umidificazione (Fig. 2). La sostituzione dello zimosterolo, il primo sterolo dell’EBP testato in questo studio (ceppo erg6Δ), con l’ergosterolo ha permesso il ripristino della resistenza al livello osservato con il ceppo WT (Tabella 2). Le principali trasformazioni chimiche che avvengono durante il processo biosintetico da zimosterolo a ergosterolo sono un cambiamento nella saturazione dell’anello B e della coda alifatica (Fig. 1B). Queste modifiche graduali potrebbero contribuire all’ottimizzazione delle proprietà biofisiche delle molecole nelle fasi successive lungo l’EBP e potrebbero spiegare l’aumento della resistenza ai cicli di asciugatura/umidificazione. I nostri risultati mostrano che i tre primi mutanti testati (erg6Δ, erg2Δ e erg3Δ) sono altamente sensibili all’asciugatura/umidificazione. La prima interruzione nell’aumento della resistenza lungo l’EBP è stata rilevata con il ceppo erg5Δ. Questa è aumentata progressivamente con erg4Δ per raggiungere un valore massimo con il ceppo WT (Fig. 2). Le strutture chimiche dei principali steroli accumulati da questi ultimi tre ceppi sono caratterizzati dalla presenza di due doppi legami nell’anello B (Fig. 1B). Durante un attacco radicale, questi doppi legami coniugati permettono la stabilizzazione dei radicali sterolici per risonanza (delocalizzazione dell’elettrone spaiato). Questa caratteristica chimica potrebbe spiegare l’effetto benefico sulla sopravvivenza all’essiccazione/umidificazione, che comporta l’ossidazione (Garre et al. 2010), proteggendo i fosfolipidi dalla perossidazione allo stesso modo della vitamina E (Packer 1991). I principali steroli accumulati dai tre ceppi con mutazioni all’inizio dell’EBP possiedono un unico doppio legame C-C in posizione C-7,8 o C-8,9, lontano dal gruppo idrossile, che non promuove la stabilizzazione del radicale per risonanza. Questo potrebbe spiegare l’alta sensibilità dei ceppi erg6Δ, erg2Δ e erg3Δ all’essiccazione sotto aria atmosferica. Il progressivo aumento della resistenza verso la fine dell’EBP (Fig. 2), osservato con i ceppi erg5Δ, erg4Δ e WT, potrebbe essere legato alla differenza tra le code alifatiche degli steroli (Fig. 1B). Infatti, la struttura della coda influenza la planarità degli steroli, che è un determinante della loro posizione nella membrana (Xu e London 2000; Bakht e London 2006). Quindi, le fasi finali del percorso dell’ergosterolo potrebbero permettere un migliore adattamento dello sterolo nella membrana, modificando parametri come la loro profondità all’interno del bilayer lipidico, per ottimizzare la protezione dei fosfolipidi dall’ossidazione. La protezione sterolo-mediata dei lipidi dall’ossidazione è già stata dimostrata su membrane modello (Wiseman 1993) ma non è mai stata dimostrata su cellule biologiche. I nostri risultati mostrano, per la prima volta, una relazione tra la natura degli steroli e la resistenza all’ossidazione. Sostengono anche un’ipotesi che ha proposto che gli steroli possono aver dato alle cellule resistenza all’ossidazione quando i livelli di ossigeno sono aumentati durante l’ossigenazione della Terra (Galea e Brown 2009; Brown e Galea 2010). Infatti, gli autori di questo studio concludono che la sintesi degli steroli, un processo dipendente dall’ossigeno (Fig. 1A), potrebbe essere stata una risposta adattativa all’aumento dell’ossigeno terrestre.

Gli esperimenti di essiccazione eseguiti sotto azoto hanno portato a tassi di sopravvivenza più elevati rispetto agli esperimenti di essiccazione all’aria per tutti i ceppi testati (Fig. 2). L’effetto dell’assenza di ossigeno durante l’essiccazione era forte per i ceppi con mutazioni nei primi componenti dell’EBP, diminuiva per quelli con mutazioni nei componenti successivi dell’EBP, ed era minore per il ceppo WT. Questi risultati mostrano che l’ossidazione gioca un ruolo importante nell’effetto letale dell’essiccazione in condizioni atmosferiche. Tuttavia, poiché il tasso di morte è rimasto sostanziale per erg6Δ, erg2Δ, erg3Δ e erg5Δ quando l’essiccazione è stata eseguita sotto azoto, concludiamo che altri fattori oltre all’ossidazione contribuiscono alla morte cellulare durante l’essiccazione. Uno di questi fattori potrebbe essere una grave costrizione meccanica sulla membrana plasmatica derivante dalla perdita di acqua dalle cellule per trasferimento osmotico (Dupont et al. 2010). Infatti, la natura degli steroli è nota per influenzare le proprietà della membrana plasmatica come la fluidità (Abe e Hiraki 2009) e i tipi di deformazione (Bacia et al. 2005; Dupont et al. 2011). Queste modifiche delle proprietà della membrana hanno portato alla rottura della membrana plasmatica e alla morte cellulare durante lo stress iperosmotico nel ceppo erg6Δ ma non nel WT (Dupont et al. 2011). La relazione tra la natura dello sterolo predominante e le proprietà di membrana si basa sulla struttura della molecola di sterolo, compresa la sua struttura planare, le dimensioni e le proprietà del suo piccolo gruppo polare 3-OH (Xu e London 2000). In particolare, il doppio legame C-7,8 dell’anello B dello sterolo, presente solo nei ceppi erg5Δ, erg4Δ e WT (Fig. 1B), è noto per essere coinvolto nell’imballaggio e nella rigidità generale della membrana plasmatica (Xu e London 2000; Bakht e London 2006). Quindi, l’evoluzione della struttura chimica degli steroli nell’EBP potrebbe sia migliorare i ruoli antiossidanti e di stabilizzatore meccanico di queste molecole nella membrana plasmatica che spiegare il progressivo aumento lungo l’EBP della resistenza dei ceppi di lievito all’essiccazione/umidificazione.

In condizioni di laboratorio classiche, la natura degli steroli non ha alcun effetto sulla crescita del lievito. Infatti, i ceppi WT e ergΔ sono cresciuti con la stessa cinetica su terreni pieni (dati non mostrati). L’accumulo di altri steroli (colesterolo, desmosterolo o campesterolo) da parte dei lieviti, indotto dalla trasformazione genetica, non influenza la crescita cellulare (Souza et al. 2011). Quindi, la natura degli steroli è cruciale per le cellule in condizioni di stress. Il fatto che la progressione lungo l’EBP aumenti la resistenza del lievito agli eventi di essiccazione/umidificazione stabilisce un potenziale legame tra questo percorso e la capacità dei funghi di sopravvivere in habitat interfacciali. Questo risultato ha importanti implicazioni per l’ipotesi di Bloch, che si basa sull’osservazione che le vie degli steroli sono parallele all’evoluzione degli steroli e che il prodotto di ogni fase dovrebbe sostenere meglio le funzioni cellulari e fisiologiche rispetto ai suoi precursori (Bloch 1983). Tuttavia, questa ipotesi, che è stata principalmente testata per la funzione strutturale degli steroli, non è mai stata supportata da fatti sperimentali. Per esempio, nel percorso del colesterolo, è stato dimostrato che alcuni precursori sono più efficienti del colesterolo per la stabilizzazione della zattera in una membrana modello (Bakht e London 2006). Il coinvolgimento dell’ergosterolo nella resistenza del lievito agli eventi di essiccazione/umidificazione potrebbe essere all’origine dell’evoluzione dell’EBP e della diffusa presenza di ergosterolo nei funghi terrestri (Weete et al. 2010). Infatti, l’evoluzione della struttura chimica degli steroli nell’EBP potrebbe aver migliorato il ruolo antiossidante e di stabilizzatore meccanico di queste molecole nella membrana plasmatica e spiegare il progressivo aumento lungo l’EBP della resistenza dei ceppi di lievito all’essiccazione/umidificazione. Questo studio, eseguito in un contesto cellulare, fornisce i primi dati sperimentali a sostegno dell’ipotesi Bloch.

Nonostante il ruolo principale che l’ergosterolo sembra giocare nella persistenza dei lieviti nel loro ambiente naturale, Weete et al., che hanno affrontato la questione della diversità degli steroli nei funghi, hanno dimostrato che l’ergosterolo non è l’unico sterolo in questo regno (Weete et al. 2010). I risultati di questo studio supportano l’idea che il colesterolo può essere considerato lo sterolo fungino più primitivo, e che l’evoluzione della struttura specifica dell’ergosterolo è stata guidata da requisiti funzionali specifici dei funghi in evoluzione. Infatti, i funghi primitivi che accumulano colesterolo sono flagellati e vivono in un ambiente acquatico (James et al. 2006; Weete et al. 2010) dove l’idratazione è massima e stabile. Questo è coerente con il fatto che il colesterolo è un efficiente stabilizzatore meccanico (Bakht e London 2006); sebbene sia meno efficace come antiossidante dell’ergosterolo (Wiseman 1993) (il colesterolo possiede solo un doppio legame nell’anello B), è meno energeticamente costoso da produrre (Parks e Casey 1995). Questi dati, uniti ai risultati del presente studio, potrebbero significare che la sintesi dell’ergosterolo conferisce un importante vantaggio per la sopravvivenza dei funghi superiori e la colonizzazione degli habitat interfacciali solido-aria.

Concludiamo che la sopravvivenza all’essiccazione e alla bagnatura è facilitata nel lievito, un eucariote unicellulare incapace di mantenere l’omeostasi dell’acqua, dall’ergosterolo. Questo componente essenziale, specifico delle membrane dei funghi, aumenta la resistenza alle costrizioni meccaniche e all’ossidazione causata dall’evaporazione dell’acqua e dall’esposizione diretta all’aria atmosferica. Pertanto, l’evoluzione dell’EBP può essere stata un elemento chiave nella conquista degli habitat interfacciali solido-aria da parte dei funghi. I risultati di questo studio suggeriscono una risposta alla persistente domanda “perché l’ergosterolo nei funghi?” (Parks e Casey 1995). I meccanismi relativi a questi risultati dovrebbero essere approfonditi in esperimenti futuri. A questo scopo, stiamo studiando le proprietà molecolari dell’ergosterolo nella membrana plasmatica per chiarire i meccanismi con cui l’ergosterolo preserva la membrana dalle alterazioni chimiche e fisiche causate dall’asciugatura e dall’umidificazione all’aria. Le applicazioni previste includono l’ottimizzazione dei metodi basati sull’essiccazione per la conservazione delle cellule eucariotiche e lo sviluppo di nuove strategie per la distruzione dei funghi coinvolti in molte attività patogene e di deterioramento degli alimenti.