Les promoteurs contrôlent la liaison de l’ARN polymérase et des facteurs de transcription. Comme la région du promoteur dirige la transcription d’un gène cible, elle détermine donc le moment de l’expression du gène et définit en grande partie la quantité de protéine recombinante qui sera produite. De nombreux promoteurs courants, comme les promoteurs du CMV, de l’EF1A et du SV40, sont toujours actifs et sont donc appelés promoteurs constitutifs. D’autres ne sont actifs que dans des circonstances spécifiques. Dans cet article, nous allons parler des promoteurs inductibles, qui peuvent passer de l’état OFF à l’état ON, et de la façon dont vous pouvez les utiliser dans vos recherches. Lorsque vous aurez terminé ce post, consultez notre post de suivi sur les promoteurs répressibles.

Comment les promoteurs inductibles sont-ils régulés ?

Les promoteurs inductibles peuvent être régulés par un contrôle positif ou négatif.

Positif inductible

À l’état OFF, le promoteur est inactif car la protéine activatrice ne peut pas se lier. Après qu’un inducteur se lie à la protéine activatrice, celle-ci peut se lier au promoteur, l’allumant et initiant la transcription.

Inductible négatif

À l’état OFF, le promoteur est inactif car une protéine répresseur liée empêche activement la transcription. Une fois qu’un inducteur se lie à la protéine répresseur, celle-ci est éliminée de l’ADN. En l’absence de la protéine répresseur, la transcription est activée.

Types de promoteurs inductibles

Les agents chimiques, la température et la lumière sont tous des exemples de facteurs qui peuvent conduire à l’induction d’un promoteur. Vous trouverez ci-dessous une brève description de ces trois types de promoteurs inductibles, ainsi que des exemples de chaque type. Beaucoup de ces systèmes de promoteurs sont disponibles chez Addgene !

Promoteurs inductibles chimiquement

Les promoteurs régulés chimiquement sont parmi les promoteurs inductibles les plus courants. Le système positif inductible tétracycline ON (Tet-On), un outil polyvalent développé pour être utilisé chez les procaryotes et les eucaryotes, fonctionne par activation directe. Dans ce système, l’activateur rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator) est normalement inactif et ne peut pas se lier aux éléments de réponse de la tétracycline (TRE) dans un promoteur. La tétracycline et ses dérivés servent d’agents inducteurs pour permettre l’activation du promoteur.

L’un des promoteurs procaryotes les plus couramment utilisés est le promoteur inductible négatif pLac. Ce promoteur nécessite l’élimination du répresseur lac (protéine lacI) pour que la transcription soit activée. En présence de lactose ou d’un analogue du lactose, l’IPTG, le répresseur lac subit un changement de conformation qui le retire des sites lacO dans le promoteur et cesse la répression du gène cible. Un système inductible lac simplifié se trouve dans de nombreux vecteurs d’expression bactériens.

Le promoteur inductible négatif pBad est un autre promoteur procaryote populaire souvent utilisé pour la purification des protéines bactériennes. Lorsque l’arabinose est absent, la protéine régulatrice AraC se lie aux sites O et I1 en amont de pBad, bloquant la transcription. L’ajout d’arabinose amène AraC à se lier aux sites I1 et I2, permettant ainsi à la transcription de commencer. En plus de l’arabinose, l’AMPc complexé avec la protéine activatrice de l’AMPc (CAP) peut également stimuler la liaison de l’AraC aux sites I1 et I2. La supplémentation du milieu de croissance cellulaire avec du glucose diminue l’AMPc et réprime pBad, diminuant la fuite du promoteur.

D’autres exemples de promoteurs induits chimiquement comprennent les promoteurs inductibles positifs à l’alcool et régulés par les stéroïdes couramment utilisés dans la recherche végétale.

Sous-type de promoteur	Exemple de promoteur	Activateur	Addgene Plasmid/Kit
Alcool-régulé	Promoteur AlcA	AlcR	pGGA008 (AlcA) et pGGC011 (AlcR) du kit GreenGate flamme rouge
Stéroïde-régulé	Promoteur LexA	XVE (synthétique)	pFZ19 (flamme jaune)

Promoteurs inductibles par la température

Les systèmes d’expression sensibles à la température sont généralement moins fuyants que les promoteurs induits chimiquement ; ils présentent une expression quasi nulle à des températures normales mais peuvent être induits par une exposition à la chaleur ou au froid. Les exemples incluent les promoteurs Hsp70 ou dérivés de Hsp90 inductibles par choc thermique, dans lesquels un gène de choix n’est exprimé qu’après exposition à un bref choc thermique. Dans le cas de Hsp70, le choc thermique libère le facteur de choc thermique 1 (HSF-1), qui se lie ensuite aux éléments de choc thermique dans le promoteur, activant ainsi la transcription. Les déposants d’Addgene ont développé Cre et Cas9 inductibles par choc thermique pour faciliter l’ingénierie du génome chez des espèces comme C. elegans et la drosophile.

Promoteurs inductibles par la lumière

La lumière est un autre moyen d’activer l’expression des gènes, et les systèmes à deux composants utilisés en biologie synthétique utilisent la lumière pour réguler la transcription. Le plasmide pDawn de la flamme rouge contient la protéine YFI de détection de la lumière bleue. En l’absence de lumière, YFI phosphoryle FixJ, qui se lie au promoteur FixK2 pour induire la transcription du répresseur cI du phage. Le répresseur cI inhibe la transcription du promoteur phagique pR, empêchant l’expression d’un gène rapporteur. En présence de lumière, YFI est inactif, empêchant la synthèse du répresseur cI et permettant la transcription du gène rapporteur. Addgene propose également des systèmes à deux composants régulés par la lumière de flamme jaune, conçus par le laboratoire Tabor.

Quel promoteur inductible me convient ?

Voici une liste de quelques variables importantes à prendre en compte lors du choix d’un promoteur inductible.

Système expérimental

Parce que la machinerie de transcription diffère entre les types de cellules ou les organismes, les promoteurs sont également variables. Les promoteurs bactériens ne fonctionnent que dans les cellules procaryotes et généralement uniquement dans la même espèce ou dans une espèce étroitement apparentée dont ils sont issus. De même, les différents types de cellules eucaryotes (mammifères, levures, plantes, etc.) nécessitent des promoteurs uniques et il y a très peu de croisements. Le mécanisme d’induction doit également être compatible avec votre système expérimental.

Fuite

Si vous exprimez un gène qui peut être toxique, il est important que votre promoteur inductible ne soit pas trop fuyant. Pour les promoteurs procaryotes inductibles, pLac est connu pour être légèrement fuyant, et pBad est probablement une meilleure option puisque l’expression peut être réprimée par le glucose. Les promoteurs inductibles par la température sont également connus pour leur faible fuite.

Niveau d’inductibilité

De combien voulez-vous induire la transcription de votre gène cible ? La force des promoteurs inductibles peut varier beaucoup. Si vous recherchez une inductibilité élevée, le système Tet-On peut être un bon choix, car il est documenté pour induire la transcription >1 000 fois lorsqu’il est activé.

Temps de latence

Le temps nécessaire pour induire un promoteur donné varie. Les promoteurs qui ne nécessitent que l’ajout d’un inducteur externe, comme les systèmes Tet, peuvent être activés très rapidement. En revanche, les systèmes de promoteurs qui nécessitent la transcription d’un répresseur/inducteur auront un temps de latence plus élevé en raison du temps nécessaire à la transcription/translation.

Merciements à Nicole Zurcher qui a contribué à la rédaction de cet article.

Ressources supplémentaires sur le blog Addgene :

• Plasmides 101 : la région du promoteur
• Plasmides 101 : Cre-lox
• Systèmes à deux composants commutables par la lumière pour E. coli
• Parcourir d’autres articles de blog de notre série Plasmides 101

.