Promotory kontrolują wiązanie polimerazy RNA i czynników transkrypcyjnych. Ponieważ region promotora napędza transkrypcję genu docelowego, określa on czas ekspresji genu i w dużym stopniu definiuje ilość rekombinowanego białka, które zostanie wyprodukowane. Wiele powszechnie stosowanych promotorów, takich jak promotory CMV, EF1A i SV40, jest zawsze aktywnych i dlatego określa się je jako promotory konstytutywne. Inne są aktywne tylko w określonych okolicznościach. W tym poście omówimy promotory indukowalne, które mogą być przełączane ze stanu OFF do ON, i jak można je wykorzystać w swoich badaniach. Kiedy skończysz z tym postem, sprawdź nasz następny post o promotorach represyjnych.

Jak regulowane są promotory indukowalne?

Promotory indukowalne mogą być regulowane przez kontrolę pozytywną lub negatywną.

Pozytywne indukowalne

W stanie OFF, promotor jest nieaktywny, ponieważ białko aktywatora nie może się do niego przyłączyć. Po związaniu induktora z białkiem aktywatora, białko aktywatora może związać się z promotorem, włączając go i inicjując transkrypcję.

Indukowalne ujemnie

W stanie OFF, promotor jest nieaktywny, ponieważ związane białko represorowe aktywnie zapobiega transkrypcji. Gdy induktor zwiąże białko represorowe, jest ono usuwane z DNA. Przy braku białka represorowego transkrypcja zostaje włączona.

Typy promotorów indukowalnych

Środki chemiczne, temperatura i światło są przykładami czynników, które mogą prowadzić do indukcji promotora. Poniżej znajduje się krótki opis tych trzech typów promotorów indukowalnych oraz przykłady każdego z nich. Wiele z tych systemów promotorowych jest dostępnych w Addgene!

Chemicznie indukowalne promotory

Chemicznie regulowane promotory należą do najczęstszych indukowalnych promotorów. Pozytywnie indukowalny system tetracyklinowy ON (Tet-On), wszechstronne narzędzie opracowane do stosowania u prokariotów i eukariotów, działa poprzez bezpośrednią aktywację. W tym systemie aktywator rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator) jest normalnie nieaktywny i nie może wiązać elementów odpowiedzi tetracyklinowej (TRE) w promotorze. Tetracyklina i jej pochodne służą jako czynniki indukujące, umożliwiające aktywację promotora.

Jednym z najczęściej stosowanych promotorów prokariotycznych jest ujemnie indukowalny promotor pLac. Promotor ten wymaga usunięcia represora lac (białka lacI), aby transkrypcja mogła zostać aktywowana. W obecności laktozy lub analogu laktozy IPTG represor lac ulega zmianie konformacyjnej, która usuwa go z miejsc lacO w obrębie promotora i zaprzestaje represji genu docelowego. Uproszczony system indukowalny lac znajduje się w wielu bakteryjnych wektorach ekspresyjnych.

Negatywny indukowalny promotor pBad jest kolejnym popularnym prokariotycznym promotorem często używanym do oczyszczania białek bakteryjnych. Gdy arabinoza jest nieobecna, białko regulatorowe AraC wiąże miejsca O i I1 w górę łańcucha pBad, blokując transkrypcję. Dodanie arabinozy powoduje, że AraC wiąże miejsca I1 i I2, umożliwiając rozpoczęcie transkrypcji. Poza arabinoz±, cAMP skompleksowany z białkiem aktywatora cAMP (CAP) może również stymulować wi±zanie AraC do miejsc I1 i I2. Uzupełnienie pożywki do wzrostu komórek glukozą obniża cAMP i represjonuje pBad, zmniejszając szczelność promotora.

Inne przykłady chemicznie indukowanych promotorów obejmują pozytywne indukowane promotory regulowane alkoholem i steroidami, powszechnie stosowane w badaniach nad roślinami.

Promoter Subtype	Promoter Example	Activator	Addgene Plasmid/Kit
Alcohol-regulowany	Promotor AlcA	AlcR	pGGA008 (AlcA) i pGGC011 (AlcR) z czerwonego płomienia GreenGate kit
Steroid-Regulowany	Promotor LexA	XVE (syntetyczny)	pFZ19 (żółty płomień)

Promotory indukowane temperaturą

Systemy ekspresji wrażliwe na temperaturę są zwykle mniej nieszczelne niż promotory indukowane chemicznie; Wykazują one prawie zerową ekspresję w normalnych temperaturach, ale mogą być indukowane przez ekspozycję na ciepło lub zimno. Przykłady obejmują indukowane szokiem cieplnym promotory Hsp70 lub Hsp90, w których wybrany gen ulega ekspresji tylko po wystawieniu na krótki szok cieplny. W przypadku Hsp70, szok cieplny uwalnia czynnik szoku cieplnego 1 (HSF-1), który następnie wiąże się z elementami szoku cieplnego w promotorze, aktywując w ten sposób transkrypcję. Deponenci Addgene opracowali indukowane szokiem cieplnym Cre i Cas9 dla łatwej inżynierii genomu u gatunków takich jak C. elegans i Drosophila.

Indukowane światłem promotory

Światło jest innym sposobem aktywacji ekspresji genów, a systemy dwuskładnikowe używane w biologii syntetycznej wykorzystują światło do regulacji transkrypcji. Plazmid czerwonego płomienia pDawn zawiera białko YFI wyczuwające światło niebieskie. Gdy nie ma światła, YFI fosforyluje FixJ, który wiąże się do promotora FixK2, aby indukować transkrypcję fagowego represora cI. Represor cI hamuje transkrypcję z fagowego promotora pR, uniemożliwiając ekspresję genu reporterowego. Gdy obecne jest światło, YFI jest nieaktywny, zapobiegając syntezie represora cI i umożliwiając transkrypcję genu reporterowego. Addgene ma również dwuskładnikowe systemy regulowane żółtym światłem płomienia zaprojektowane przez laboratorium Tabora.

Który promotor indukowalny jest dla mnie odpowiedni?

Oto lista kilku ważnych zmiennych do rozważenia przy wyborze promotora indukowalnego.

System doświadczalny

Ponieważ mechanizmy transkrypcji różnią się między typami komórek lub organizmów, promotory są podobnie zmienne. Bakteryjne promotory działają tylko w komórkach prokariotycznych i zazwyczaj tylko w tym samym lub blisko spokrewnionym gatunku, z którego zostały wyprowadzone. Podobnie, różne typy komórek eukariotycznych (ssaki, drożdże, rośliny, itd.) wymagają unikalnych promotorów i bardzo rzadko dochodzi do krzyżowania. Mechanizm indukcji musi być również zgodny z systemem doświadczalnym.

Nieszczelność

Jeśli ekspresja genu może być toksyczna, ważne jest, aby indukowalny promotor nie był zbyt nieszczelny. W przypadku indukowalnych promotorów prokariotycznych, pLac jest znany jako nieco nieszczelny, a pBad jest prawdopodobnie lepszą opcją, ponieważ ekspresja może być tłumiona przez glukozę. Indukowalne promotory temperaturowe są również znane ze swojej małej nieszczelności.

Poziom indukowalności

Jak bardzo chcesz indukować transkrypcję swojego genu docelowego? Siła indukowalnych promotorów może się bardzo różnić. Jeśli szukasz wysokiej indukowalności, dobrym wyborem może być system Tet-On, ponieważ udokumentowano, że może on indukować transkrypcję >1000 razy po aktywacji.

Czas opóźnienia

Czas potrzebny do indukcji danego promotora jest różny. Promotory, które wymagają jedynie dodania zewnętrznego czynnika indukującego, jak systemy Tet, mogą być aktywowane bardzo szybko. Z kolei systemy promotorowe, które wymagają transkrypcji represora/induktora, będą miały dłuższy czas opóźnienia ze względu na czas potrzebny na transkrypcję/translację.

Wielkie podziękowania dla Nicole Zurcher, która przyczyniła się do napisania tego artykułu.

Dodatkowe zasoby na blogu Addgene:

• Plazmidy 101: Region promotora
• Plazmidy 101: Cre-lox
• Przełączalne światłem dwukomponentowe systemy dla E. coli
• Przeglądaj inne posty z serii Plazmidy 101

.