Promotory řídí vazbu RNA polymerázy a transkripčních faktorů. Protože promotorová oblast řídí transkripci cílového genu, určuje tedy načasování genové exprese a do značné míry definuje množství rekombinantního proteinu, který bude produkován. Mnoho běžných promotorů, jako jsou promotory CMV, EF1A a SV40, je vždy aktivních, a proto se označují jako konstitutivní promotory. Jiné jsou aktivní pouze za určitých okolností. V tomto příspěvku se budeme zabývat indukovatelnými promotory, které lze přepínat z vypnutého do zapnutého stavu, a tím, jak je můžete využít ve svém výzkumu. Až dočtete tento příspěvek, podívejte se na náš navazující příspěvek o represibilních promotorech.

Jak se regulují indukovatelné promotory?

Indukovatelné promotory mohou být regulovány pozitivní nebo negativní kontrolou.

Pozitivní indukovatelné

Ve vypnutém stavu je promotor neaktivní, protože se na něj nemůže vázat aktivační protein. Po navázání induktoru na aktivační protein se aktivační protein může navázat na promotor, zapnout jej a zahájit transkripci.

Negativně indukovatelný

Ve vypnutém stavu je promotor neaktivní, protože navázaný represorový protein aktivně brání transkripci. Jakmile induktor naváže represorový protein, represorový protein se z DNA odstraní. Při nepřítomnosti represorového proteinu je transkripce zapnuta.

Typy indukovatelných promotorů

Chemické látky, teplota a světlo jsou příklady faktorů, které mohou vést k indukci promotoru. Níže najdete stručný popis těchto tří typů indukovatelných promotorů a příklady jednotlivých typů. Mnoho z těchto promotorových systémů je k dispozici u společnosti Addgene!

Chemicky indukovatelné promotory

Chemicky regulované promotory patří mezi nejběžnější indukovatelné promotory. Pozitivně indukovatelný tetracyklinový systém ON (Tet-On), univerzální nástroj vyvinutý pro použití u prokaryot a eukaryot, funguje prostřednictvím přímé aktivace. V tomto systému je aktivátor rtTA (reverzní transaktivátor řízený tetracyklinem) normálně neaktivní a nemůže vázat prvky tetracyklinové odpovědi (TRE) v promotoru. Tetracyklin a jeho deriváty slouží jako induktory umožňující aktivaci promotoru.

Jedním z nejčastěji používaných prokaryotických promotorů je negativně indukovatelný promotor pLac. Tento promotor vyžaduje pro aktivaci transkripce odstranění lac represoru (lacI proteinu). V přítomnosti laktózy nebo analogu laktózy IPTG projde lac represor konformační změnou, která ho odstraní z lacO míst v promotoru a ukončí represi cílového genu. Zjednodušený indukovatelný systém lac se nachází v mnoha bakteriálních expresních vektorech.

Negativní indukovatelný promotor pBad je dalším oblíbeným prokaryotickým promotorem často používaným pro čištění bakteriálních proteinů. Při nepřítomnosti arabinózy se regulační protein AraC váže na místa O a I1 před pBad a blokuje transkripci. Přidání arabinózy způsobí, že AraC naváže místa I1 a I2, což umožní zahájení transkripce. Kromě arabinózy může vazbu AraC na místa I1 a I2 stimulovat také cAMP v komplexu s proteinem cAMP aktivátoru (CAP). Doplnění buněčného růstového média glukózou snižuje cAMP a potlačuje pBad, čímž se snižuje propustnost promotoru.

Dalšími příklady chemicky indukovaných promotorů jsou pozitivně indukovatelné alkoholové a steroidní regulované promotory běžně používané v rostlinném výzkumu.

Podtyp promotoru	Příklad promotoru	Aktivátor	Addgene Plasmid/Kit
Alkoholový-regulovaný	AlcA promotor	AlcR	pGGA008 (AlcA) a pGGC011 (AlcR) z red flame GreenGate kitu
Steroid-regulovaný	LexA promotor	XVE (syntetický)	pFZ19 (žlutý plamen)

Temperaturně indukovatelné promotory

Temperaturně citlivé expresní systémy jsou obvykle méně propustné než chemicky indukované promotory; vykazují téměř nulovou expresi při běžných teplotách, ale mohou být indukovány působením tepla nebo chladu. Příkladem jsou tepelným šokem indukovatelné promotory odvozené od Hsp70 nebo Hsp90, u nichž se vybraný gen exprimuje pouze po vystavení krátkému tepelnému šoku. V případě Hsp70 uvolňuje tepelný šok faktor 1 (HSF-1), který se následně váže na elementy tepelného šoku v promotoru, čímž aktivuje transkripci. Depozitáři Addgene vyvinuli tepelným šokem indukovatelný Cre a Cas9 pro snadné genomové inženýrství u druhů, jako jsou C. elegans a Drosophila.

Světlem indukovatelné promotory

Světlo je další způsob aktivace genové exprese a dvousložkové systémy používané v syntetické biologii využívají k regulaci transkripce světlo. Plazmid pDawn s červeným plamenem obsahuje protein YFI vnímající modré světlo. Při nepřítomnosti světla YFI fosforyluje FixJ, který se váže na promotor FixK2 a indukuje transkripci fágového represoru cI. Represor cI inhibuje transkripci z fágového promotoru pR, čímž zabraňuje expresi reportérového genu. Když je přítomno světlo, YFI je neaktivní, zabraňuje syntéze represoru cI a umožňuje transkripci reportérového genu. Addgene má také dvousložkové systémy regulované světlem žlutého plamene navržené laboratoří Tabor.

Který indukovatelný promotor je pro mě ten pravý?

Tady je seznam některých důležitých proměnných, které je třeba zvážit při výběru indukovatelného promotoru.

Experimentální systém

Protože se transkripční mechanismus liší mezi jednotlivými typy buněk nebo organismů, promotory jsou podobně variabilní. Bakteriální promotory fungují pouze v prokaryotických buňkách a obvykle pouze ve stejném nebo blízce příbuzném druhu, ze kterého byly odvozeny. Podobně různé typy eukaryotických buněk (savčí, kvasinkové, rostlinné atd.) vyžadují jedinečné promotory a jejich křížení je velmi malé. Indukční mechanismus musí být také kompatibilní s vaším experimentálním systémem.

Těsnost

Pokud exprimujete gen, který může být toxický, je důležité, aby váš indukovatelný promotor nebyl příliš děravý. U indukovatelných prokaryotických promotorů je známo, že pLac je mírně děravý, a pBad je pravděpodobně lepší volbou, protože exprese může být potlačena glukózou. Teplotně indukovatelné promotory jsou také známé svou nízkou děravostí.

Úroveň indukovatelnosti

Jak moc chcete indukovat transkripci cílového genu? Síla indukovatelných promotorů se může velmi lišit. Pokud hledáte vysokou indukovatelnost, může být dobrou volbou systém Tet-On, u kterého je zdokumentováno, že po aktivaci indukuje transkripci >1000krát.

Doba indukce

Doba potřebná k indukci daného promotoru se liší. Promotory, které vyžadují pouze přidání vnějšího induktoru, jako jsou systémy Tet, mohou být aktivovány velmi rychle. Naproti tomu promotorové systémy, které vyžadují transkripci represoru/induktoru, budou mít vyšší dobu zpoždění vzhledem k době potřebné pro transkripci/translaci.

Mnohokrát děkuji Nicole Zurcher, která přispěla k napsání tohoto článku.

Další zdroje na blogu Addgene:

• Plasmidy 101: Promotorová oblast
• Plasmidy 101: Cre-lox
• Světelně přepínatelné dvousložkové systémy pro E. coli
• Prohlédněte si další příspěvky na blogu ze série Plasmidy 101

.