Promotoren kontrollieren die Bindung von RNA-Polymerase und Transkriptionsfaktoren. Da die Promotorregion die Transkription eines Zielgens steuert, bestimmt sie daher den Zeitpunkt der Genexpression und bestimmt weitgehend die Menge des rekombinanten Proteins, das produziert wird. Viele gängige Promotoren, wie CMV-, EF1A- und SV40-Promotoren, sind immer aktiv und werden daher als konstitutive Promotoren bezeichnet. Andere sind nur unter bestimmten Umständen aktiv. In diesem Beitrag befassen wir uns mit induzierbaren Promotoren, die von einem AUS- in einen EIN-Zustand geschaltet werden können, und wie Sie diese in Ihrer Forschung einsetzen können. Wenn Sie mit diesem Beitrag fertig sind, lesen Sie unseren Folgebeitrag über unterdrückbare Promotoren.

Wie werden induzierbare Promotoren reguliert?

Induzierbare Promotoren können durch positive oder negative Kontrolle reguliert werden.

Positiv induzierbar

Im AUS-Zustand ist der Promotor inaktiv, weil das Aktivatorprotein nicht binden kann. Nachdem ein Induktor an das Aktivatorprotein bindet, kann das Aktivatorprotein an den Promotor binden, ihn einschalten und die Transkription einleiten.

Negativ induzierbar

Im OFF-Zustand ist der Promotor inaktiv, weil ein gebundenes Repressorprotein die Transkription aktiv verhindert. Sobald ein Induktor das Repressorprotein bindet, wird das Repressorprotein von der DNA entfernt. In Abwesenheit des Repressorproteins wird die Transkription eingeschaltet.

Typen induzierbarer Promotoren

Chemische Wirkstoffe, Temperatur und Licht sind Beispiele für Faktoren, die zur Induktion eines Promotors führen können. Im Folgenden finden Sie eine kurze Beschreibung dieser drei Arten von induzierbaren Promotoren und Beispiele für jeden Typ. Viele dieser Promotorsysteme sind bei Addgene erhältlich!

Chemisch induzierbare Promotoren

Chemisch regulierte Promotoren gehören zu den häufigsten induzierbaren Promotoren. Das positiv induzierbare Tetracyclin-ON-System (Tet-On), ein vielseitiges Werkzeug, das für den Einsatz in Prokaryonten und Eukaryonten entwickelt wurde, funktioniert durch direkte Aktivierung. Bei diesem System ist der Aktivator rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator) normalerweise inaktiv und kann die Tetracyclin-Response-Elemente (TRE) in einem Promotor nicht binden. Tetracyclin und seine Derivate dienen als Induktionsmittel, um die Aktivierung des Promotors zu ermöglichen.

Einer der am häufigsten verwendeten prokaryotischen Promotoren ist der negativ induzierbare pLac-Promotor. Dieser Promotor erfordert die Entfernung des lac-Repressors (lacI-Protein), damit die Transkription aktiviert werden kann. In Gegenwart von Laktose oder dem Laktoseanalogon IPTG erfährt der lac-Repressor eine Konformationsänderung, die ihn von den lacO-Stellen innerhalb des Promotors entfernt und die Unterdrückung des Zielgens beendet. Ein vereinfachtes lac-induzierbares System findet sich in vielen bakteriellen Expressionsvektoren.

Der negative induzierbare Promotor pBad ist ein weiterer beliebter prokaryotischer Promotor, der häufig für die bakterielle Proteinreinigung verwendet wird. In Abwesenheit von Arabinose bindet das regulatorische Protein AraC an die O- und I1-Stellen stromaufwärts von pBad und blockiert die Transkription. Durch die Zugabe von Arabinose bindet AraC an die I1- und I2-Stellen, so dass die Transkription beginnen kann. Zusätzlich zu Arabinose kann auch cAMP, das mit dem cAMP-Aktivatorprotein (CAP) komplexiert ist, die Bindung von AraC an die I1- und I2-Stellen stimulieren. Die Zugabe von Glukose zum Zellwachstumsmedium senkt cAMP und unterdrückt pBad, wodurch die Leckage des Promotors verringert wird.

Weitere Beispiele für chemisch induzierte Promotoren sind positiv induzierbare alkohol- und steroidregulierte Promotoren, die in der Pflanzenforschung häufig verwendet werden.

Promotor Subtyp	Promotor Beispiel	Aktivator	Addgene Plasmid/Kit
Alkohol-.reguliert	AlcA-Promotor	AlcR	pGGA008 (AlcA) und pGGC011 (AlcR) aus dem Red Flame GreenGate Kit
Steroid-regulierter	LexA-Promotor	XVE (synthetisch)	pFZ19 (gelbe Flamme)

Temperaturinduzierbare Promotoren

Temperatursensitive Expressionssysteme sind in der Regel weniger undicht als chemisch induzierte Promotoren; Sie zeigen bei normalen Temperaturen fast keine Expression, können aber durch Hitze- oder Kälteeinwirkung induziert werden. Beispiele hierfür sind die Hitzeschock-induzierbaren Hsp70- oder Hsp90-Promotoren, bei denen ein gewünschtes Gen nur nach einem kurzen Hitzeschock exprimiert wird. Im Fall von Hsp70 wird durch den Hitzeschock der Hitzeschockfaktor 1 (HSF-1) freigesetzt, der anschließend an Hitzeschockelemente im Promotor bindet und so die Transkription aktiviert. Die Hinterleger von Addgene haben Hitzeschock-induzierbare Cre- und Cas9-Promotoren entwickelt, um das Genome Engineering in Spezies wie C. elegans und Drosophila zu vereinfachen.

Licht-induzierbare Promotoren

Licht ist eine weitere Möglichkeit, die Genexpression zu aktivieren, und Zweikomponentensysteme, die in der synthetischen Biologie verwendet werden, nutzen Licht zur Regulierung der Transkription. Das Rotflammenplasmid pDawn enthält das Blaulicht-Protein YFI. Bei Abwesenheit von Licht phosphoryliert YFI FixJ, das sich an den FixK2-Promotor bindet, um die Transkription des Phagenrepressors cI einzuleiten. Der Repressor cI hemmt die Transkription des Phagenpromotors pR und verhindert so die Expression eines Reportergens. Wenn Licht vorhanden ist, ist YFI inaktiv und verhindert die Synthese von Repressor cI, so dass die Transkription des Reportergens stattfinden kann. Addgene verfügt auch über Zwei-Komponenten-Systeme mit gelber Flamme, die vom Tabor-Labor entwickelt wurden.

Welcher induzierbare Promotor ist der richtige für mich?

Hier ist eine Liste einiger wichtiger Variablen, die bei der Auswahl eines induzierbaren Promotors zu berücksichtigen sind.

Experimentelles System

Da sich die Transkriptionsmaschinerie zwischen Zelltypen oder Organismen unterscheidet, sind auch die Promotoren ähnlich variabel. Bakterielle Promotoren funktionieren nur in prokaryontischen Zellen und in der Regel nur in derselben oder einer eng verwandten Art, von der sie abstammen. Auch die verschiedenen eukaryotischen Zelltypen (Säugetiere, Hefen, Pflanzen usw.) benötigen einzigartige Promotoren, und es gibt nur sehr wenige Überschneidungen. Der Induktionsmechanismus muss auch mit Ihrem Versuchssystem kompatibel sein.

Durchlässigkeit

Wenn Sie ein Gen exprimieren, das toxisch sein könnte, ist es wichtig, dass Ihr induzierbarer Promotor nicht zu durchlässig ist. Bei induzierbaren prokaryotischen Promotoren ist pLac dafür bekannt, dass er leicht undicht ist, und pBad ist wahrscheinlich eine bessere Wahl, da die Expression durch Glukose unterdrückt werden kann. Auch temperaturinduzierbare Promotoren sind für ihre geringe Undichtigkeit bekannt.

Induzierbarkeitsgrad

Wie stark wollen Sie die Transkription Ihres Zielgens induzieren? Die Stärke von induzierbaren Promotoren kann sehr unterschiedlich sein. Wenn Sie eine hohe Induzierbarkeit wünschen, könnte das Tet-On-System eine gute Wahl sein, da es nachweislich die Transkription >1.000-fach induziert, wenn es aktiviert wird.

Verzögerungszeit

Die Zeit, die benötigt wird, um einen bestimmten Promotor zu induzieren, variiert. Promotoren, die nur die Zugabe eines externen Induktors benötigen, wie Tet-Systeme, können sehr schnell aktiviert werden. Im Gegensatz dazu haben Promotorsysteme, die die Transkription eines Repressors/Induktors erfordern, aufgrund der für die Transkription/Translation benötigten Zeit eine längere Verzögerungszeit.

Vielen Dank an Nicole Zurcher, die zum Schreiben dieses Artikels beigetragen hat.

Zusätzliche Ressourcen auf dem Addgene Blog:

• Plasmide 101: Die Promotor-Region
• Plasmide 101: Cre-lox
• Lichtschaltbare Zwei-Komponenten-Systeme für E. coli
• Suchen Sie andere Blog-Beiträge aus unserer Plasmids 101 Serie