Abstract

Den aktuelle undersøgelse præsenterer den simultane kvantificering af dexpanthenol og resorcinol fra markedsført hårplejeformulering. Dexpanthenol er ofte til stede som en aktiv ingrediens i produkter til personlig pleje på grund af dets forskønnende og opkvikkende egenskaber og genopbyggende og udglattende egenskaber. På den anden side er resorcinol hovedsagelig ordineret til behandling af seborrheisk dermatitis i hovedbunden. De toksiske bivirkninger af resorcinol begrænser dets anvendelse i dermatologiske præparater. Derfor kan en nøjagtig kvantificeringsteknik til samtidig estimering af disse to komponenter være nyttig for formuleringsindustrien med henblik på en nøjagtig analyse af deres produktkvalitet. I den foreliggende undersøgelse er der udviklet en højtydende væskekromatografisk teknik ved hjælp af en C18-kolonne og en mobil fase bestående af fosfatbuffer med en pH = 2,8 efter en gradient eluering. Den mobile fases strømningshastighed var 0,6 mL pr. minut, og detektionsbølgelængden var 210 nm for dexpanthenol og 280 nm for resorcinol. Linearitetsundersøgelsen blev udført ved hjælp af fem opløsninger med koncentrationer på mellem 10,34 μg-mL-1 og 82,69 μg-mL-1 () for resorcinol og 10,44 μg-mL-1 og 83,50 μg-mL-1 () for dexpanthenol. Metoden er blevet valideret i overensstemmelse med ICH Q2(R1)-retningslinjerne. Den nemme prøveforberedelse i et enkelt trin, nøjagtighed og præcision (intradag og interdag) viser, at metoden er velegnet til samtidig kvantificering af dexpanthenol og resorcinol fra alle produkter til personlig pleje og dermatologiske præparater, der indeholder disse to ingredienser.

1. Indledning

Dexpanthenol (DP) er den alkoholiske analog af D-pantothensyre. Kemisk set er det 2,4-dihydroxy-N-(3-hydroxypropyl)-3,3-dimethyl-1-butanamid, der almindeligvis findes som aktiv bestanddel i en række kosttilskud og kosmetiske produkter (cremer, salver, lotioner osv.) med henblik på deres forskønnende og opkvikkende egenskaber samt genopbyggende og udglattende egenskaber . DP absorberes gennem huden og omdannes til sin aktive form, pantothensyre (vitamin B5), som er forløberen for biosyntesen af coenzym A. Syreformen spiller en vigtig rolle i Krebscyklus . Pantothensyre betragtes også som “antistress-vitaminer”, da mangel på pantothensyre kan resultere i forskellige typer sygdomme som irritation af huden, dermatitis, depigmentering af håret og forstyrret vækst . I dermatologiske præparater gives det normalt i en styrke på 2 til 5 %. På grund af dets genopbyggende, udglattende egenskaber og antidermatitis- og depigmenteringsegenskaber anvendes det ofte i hårplejeprodukter og i visse vitaminformuleringer.

Den næste kandidat under vores undersøgelse er resorcinol (RC) eller benzen-1,3-diol. Det har en række farmaceutiske anvendelser som f.eks. behandling af acain, seborrheisk dermatitis, eksem, psoriasis og andre hudlidelser. Det anvendes også i hårfarvningsmidler. Dette molekyle har imidlertid en række bivirkninger ved langtidsbrug eller i store doser . Forskning viser, at langtidsbrug af RC fører til reversible virkninger på den menneskelige skjoldbruskkirtel, hvilket resulterer i hypothyroidisme . Derfor er det vigtigt at have en nøjagtig metode til kvantificering af RC i formuleringer, der er ordineret til medicinsk og kosmetisk brug.

Flere kosmetiske og farmaceutiske præparater indeholder både RC og DP enten i form af hjælpestoffer eller som aktive bestanddele, og der er meget få metoder til kvantificering af dem i sådanne formuleringer. De fleste af de rapporterede teknikker omfatter metoder for enten RC eller DP. De fleste af de metoder, der er beskrevet til kvantificering af RC, er spektrofotometriske teknikker, og kun meget få kromatografiske teknikker er beskrevet. I en anden undersøgelse, der blev gennemført i vores laboratorium, udviklede vi en teknik til kvantificering af RC udelukkende fra et markedsført hårplejeprodukt ved hjælp af en isokratisk elueringsteknik ved hjælp af flydende kromatografi . Denne metode er imidlertid ikke egnet til kvantificering af DP fra en sådan formulering, hvilket inspirerede os til at udvikle denne nyere teknik. For DP er der kun blevet rapporteret om en enkelt valideret superkritisk væskekromatografisk metode . Metoden beskriver kvantificering af den aktive D-form i en racemisk blanding af D- og L-former af panthenol fra kosmetiske formuleringer ved hjælp af en massespektroskopisk detektor. I den aktuelle undersøgelse præsenteres en enkel, hurtig, præcis og valideret teknik til samtidig kvantificering af både DP og RC fra et markedsført hårplejeprodukt i tilstedeværelse af en kompleks matrix bestående af glycerin, ethanol, biotin, keratinhydrolysat, hyalkyl HBU, nikotinsyre og polyvinylpyrrolidon.

2. Materiale og metoder

Dexpanthenol (DP)-standard (renhed 99,65%) og resorcinol (RC)-standard (renhed 99,98%) blev købt fra Sigma Aldrich India Ltd. Hårplejeformulering indeholdende DP og RC med batchnummer HV1124, fremstillingsdato februar 2015 og udløbsdato juli 2017 blev anvendt som en repræsentativ markedsført formulering til undersøgelsen. Opløsningsmidler af kromatografikvalitet blev købt fra Spectrochem India Limited. En C18-kolonne med en længde på 100 mm og en indre diameter på 4,0 mm blev købt hos Waters Limited (Waters MA, USA). Alle reagenser, der blev anvendt i analysen, blev købt hos Merck India Limited.

2.1. Udstyr og kromatografiske betingelser

Der blev anvendt et quaternært gradientsystem med Waters Alliance Separation Module (Waters, USA) og en Waters 2489 dobbelt lambda-absorptionsdetektor til kvantificeringsformål. Analysen blev udført ved hjælp af Empower 3-software (Waters, USA). Til analysen blev der anvendt en Waters C18-kolonne i omvendt fase (Waters, USA) med en længde på 100 mm, en indre diameter på 4,0 mm, en partikelstørrelse på 5 μm og en gradienteluktionsstrømningshastighed på 0,6 mL/min. Den mobile fase var en kombination af filtreret og afgaset 5,4 mM fosfatbuffer (pH = 2,8) og acetonitril (ACN) i de i tabel 1 viste proportioner.

Analysen blev udført ved omgivelsestemperatur, og injektionsvolumenet var 20 μl. Detektionsbølgelængden var 210 nm for DP og 280 nm for RC. Før den kromatografiske separation blev både standard- og prøveopløsningerne filtreret gennem et 0,2 μm membranfilter (Pall Life science, Indien).

2.2. Tilberedning af standardopløsninger og prøveopløsninger

2.2.2.1. Standardopløsning

RC- og DP-stamopløsningerne blev fremstillet ved at opløse 51,68 mg RC (opløsning A) og 52,19 mg DP (opløsning B) i 100 mL fortyndingsmidler (90 % buffer og 10 % acetonitril) i to separate rene og tørre målekolber ved hjælp af ultralyd. Opløsning A blev fortyndet til intervallet 10,34 μg-mL-1 til 82,69 μg-mL-1 og opløsning B 10,44 μg-mL-1 til 83,50 μg-mL-1 ved hjælp af fortyndingsmidlerne til analyse (tabel 1). Der blev udarbejdet en kurve for toppunktsareal mod koncentration (figur 1(a) for RC og figur 1(b) for DP), som blev anvendt til bestemmelse af metodens linearitet, og den samme kurve blev anvendt til kvantificeringsformål. Resultaterne blev præsenteret i tabel 2(a og b) for henholdsvis RC og DP. Kurvetilpasningen blev foretaget ved hjælp af den mindste kvadratmetode.

(a)

(b)

(a)
(b)

2.2.2. Prøveopløsning

Fremstillingen af prøveopløsningen var kritisk, da der var en række interfererende stoffer til stede i matrixen som glycerin, ethanol, biotin, keratinhydrolysat, hyalkyl HBU, nikotinsyre og polyvinylpyrrolidon. I vores undersøgelse er metoden imidlertid blevet optimeret efter en enkel prøveforberedelsesteknik i et enkelt trin, som var meget velegnet til regelmæssig analyse. 2 mL af formuleringen blev pipetteret nøjagtigt ud og overført til en ren og tør målekolbe og fortyndet til 25 mL med mobil fase. Denne opløsning blev indsprøjtet i det kromatografiske system efter filtrering gennem et 0,2 μm membranfilter.

2.2.3. Metodevalidering

Den højtydende væskekromatografiteknik til samtidig kvantificering af RC og DP blev udført efter ekstern kalibreringsmetode . Analysemetoden blev valideret på grundlag af metodens nøjagtighed, præcision, linearitet, interval og robusthed. Den foreslåede metodes pålidelighed og nøjagtighed blev bestemt på grundlag af genfindingsundersøgelser. Prøveopløsningen blev tilsat standardopløsning i tre forskellige niveauer (80 %, 110 % og 120 % af analyseniveauet for hver af RC og DP mærket som henholdsvis RA, RB og RC og DA, DB og DC) . Metodens præcession blev undersøgt på grundlag af præcession af seks gentagne injektioner af standardopløsningen. Lineariteten blev fastslået ved udarbejdelse af en standardlinearitetskurve i koncentrationsområdet fra 10,34 μg-mL-1 til 82,69 μg-mL-1 for RC og fra 10,44 μg-mL-1 til 83,50 μg-mL-1 for DP (figur 2). De samme kurver blev anvendt til kvantificeringsformål. Intradagspræcisionen blev beregnet ved hjælp af seks injektioner i det højere koncentrationsområde (41,34 μg-mL-1 for RC og 41,75 μg-mL-1 for DP) på samme dag og på forskellige dage for at opnå interdagspræcisionen. Undersøgelsen af toprensitet blev anvendt til at bestemme metodens specificitet. Der blev anvendt en fotodiode array-detektor (PDA) til formålet i stedet for den tidligere nævnte UV-detektor, idet de øvrige kromatografiske betingelser blev bibeholdt uændrede. Kvantificeringsgrænsen (LOQ) og detektionsgrænsen (LOD) blev bestemt efter den teknik, der er beskrevet andetsteds . Metodens robusthed blev bestemt ved at udføre forsøg på instrumenter af forskellige fabrikater. Der blev foretaget små ændringer i de kromatografiske betingelser som f.eks. sammensætning (±5%) og pH-værdi (±0,1%) af den mobile fase for at undersøge metodens robusthed.

(a)

(b)

(a)
(b)

(a)
(b)

Figur 2

Kurve for koncentration i forhold til topareal for RC (a) og DP (b) analyse.

Det resultat, der blev opnået fra hvert trin, blev underkastet statistisk analyse baseret på Sigma-plot-software (version 8.02 SPSS Inc., USA) og MS Excel 2007. Dataene blev registreret i gentagelser og præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse for gentagelsesmålingerne.

3. Resultater og diskussioner

Den gennemsnitlige løbetid for analysen var 28 minutter, og den gennemsnitlige retentionstid for RC var minutter og for DP var minutter og for RC og DP var minutter og minutter i prøveopløsninger. Der blev observeret tilstrækkelig opløsning mellem RC og DP i standardkromatogrammet og i prøvekromatogrammet, og de tæt eluerende toppe viste tilstrækkelig opløsning i prøvekromatogrammet (figur 3 og 4). Dette var sandsynligvis den første teknik til samtidig kvantificering af begge dele af et markedsført hårplejeprodukt, der er rapporteret. for RC blev fundet ved 280 nm og for DP ved 210 nm. Derfor blev analysen udført ved hjælp af en dobbelt lambdaabsorbansdetektor med samtidig scanning ved 210 nm og 280 nm. Den kromatografiske renhed for hver komponent blev analyseret ved hjælp af en PDA-detektor for hver af de pågældende komponenter. Toppen af renhedsvinklen for RC og DP var henholdsvis 0,129 og 0,217, og tærskelværdien for toprensitet var henholdsvis 0,337 og 0,411. Analysetoppene var således symmetriske, rene og spektralt homogene, og der er tilstrækkelig opløsning mellem de respektive analysetoppe i prøvekromatogrammet (figur 3(b) og 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 3

Representative kromatogrammer for resorcinolstandard (a) og prøve (b).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 4

Representativt kromatogram for dexpanthenolstandard (a) og prøve (b).

3.1. Validering af den udviklede metode

Kvantificeringen af RC blev udført på grundlag af peakarealet og for DP på grundlag af peakhøjden. Den tidligere omtalte analysemetode blev valideret i overensstemmelse med USP- og ICH Q2(R1)-retningslinjerne. De respektive parametre for undersøgelsen blev præsenteret som følger:

3.1.1.1. Systemets egnethed

Det kromatografiske systems egnethed til udførelse af analysen blev undersøgt på grundlag af systemets egnethed. Den blev normalt repræsenteret i form af kolonneeffektivitet, opløsning, kapacitetsfaktor og tailingfaktor. De teoretiske plader, der normalt præsenteres ved hjælp af bogstavet “”, definerer kolonneeffektiviteten, et mål for topskarphed, og var vigtige for påvisning af sporstoffer. Bestemmelsen af topopløsningen eller opløsningsfaktoren “” blev foretaget for at sikre, at de tæt eluerende forbindelser var godt adskilt fra hinanden, for at sikre systemets generelle opløsningsevne og også for at sikre, at de interne standarder var godt opløst i forhold til analyt-toppen. Kapacitetsfaktoren “” var et mål for massefordelingen af analysanden mellem den stationære og den mobile fase. Topasymmetrien blev normalt udtrykt som symmetrifaktor eller tailingfaktor. En værdi på en enhed blev tildelt for en perfekt symmetrisk top, og den samme værdi stiger med stigningen i topens “tailing”. For en perfekt symmetrisk top var værdien en enhed, og den samme værdi stiger, efterhånden som tailing bliver mere udtalt. Resultaterne blev opsummeret som teoretiske plader (for RC og DP), kapacitetsfaktor (for RC og 1,32 for DP), spidsasymmetri eller tailingfaktor (for RC og 0,56 for DP) (tabel 3) .

Parametre Resorcinol Dexpanthenol Systemegnethed Forholdstid (min) 7.19 3.19 Kapacitetsfaktor 1.08 1.32 Peak-opløsning 15.41 – Tailing factor 0.97 0.56 Teoretiske plader () Følsomhed LOD (µg-mL-1) 2.19 0,62 LOQ (µg-mL-1) 6,64 1.89 Præcision Intradag Middelindhold (mg/100 mL) () ± % RSD 50.41 ± 0.19 49.77 ± 0.20 Interdag Middelværdi af indhold (mg/100 mL) (dag 1/dag 2/dag 3) () 50.40/50.38/50.39 49.76/49.78/49.65 (% RSD) (dag 1/dag 2/dag 3) () 0.20/0.19/0.19/0.21 0,11/0,19/0,15 Specificitet Peak purity angle 0.129 0.217 Tærskelværdien for maksimal renhed 0.337 0.217 0.411

Med hensyn til DP.

Tabel 3

Systemegnethed og metodevalideringsdata for den simultane kvantificering af DP og RC.

3.1.2. Linearitet og interval

For at undersøge metodens linearitet blev der anvendt standardopløsninger i koncentrationsområdet fra 3,08 μg-mL-1 til 24,67 μg-mL-1 for RC og fra 10,44 μg-mL-1 til 83,50 μg-mL-1 for DP. Det resultat, der blev opnået ved analysen, blev anvendt til at udarbejde linearitetskurven. Den således fremkomne kurve viste sig at være lineær med regressionsfaktor og ligning for RC og og ligning for DP (figur 2). Detektionsgrænsen (LOD) og kvantificeringsgrænsen (LOQ), der blev bestemt ved hjælp af linearitetskurven, var henholdsvis 2,19 μg-mL-1 og 6,64 μg-mL-1 for RC og 0,62 μg-mL-1 og 1,89 μg-mL-1 for DP (tabel 3). Resultaterne forklarede teknikkens følsomhed inden for det pågældende analyseområde .

3.1.3. Nøjagtighed

Nøjagtigheden var et mål for nøjagtigheden af de testresultater, der er opnået ved denne procedure, i forhold til den sande værdi. Det er nødvendigt at fastslå procedurens nøjagtighed i det pågældende koncentrationsområde. I denne undersøgelse blev nøjagtigheden analyseret på grundlag af genfindingsundersøgelsen. Der blev fremstillet tre forskellige opløsninger i koncentrationsintervaller på henholdsvis 80 %, 110 % og 120 % af den beregnede testkoncentration for DP og RC. Opløsningerne blev fremstillet ved at tilsætte en kendt mængde af standardopløsningerne (opløsning A og B) til de respektive prøveopløsninger. Resultaterne viste en gennemsnitlig genfinding på 100,28 % med en % RSD på 0,82 for RC og henholdsvis 100,02 % og 0,48 for DP (tabel 4). Der blev derfor konstateret en betydelig nøjagtighed i hele undersøgelsesområdet.

3.1.4. Præcession

I vores undersøgelse blev præcessionen fastlagt på grundlag af standardafvigelsen eller den relative standardafvigelse for en række målinger som gentagelighed og mellemliggende præcession af den udviklede teknik. Til undersøgelse af repeterbarhed blev seks prøveopløsninger ved 100 % af testkoncentrationen fremstillet separat og analyseret ved hjælp af den analysemetode, der er genstand for undersøgelsen. Den samme prøveopløsning blev injiceret i tre eksemplarer i tre på hinanden følgende dage, og det således opnåede resultat blev anvendt til bestemmelse af den intermediære præcession. Præcessionen inden for en dag viste en % RSD-værdi på 0,19, og præcessionen mellem dagene varierede fra 0,19 % til 0,21 % kun for RC og 0,20 og 0,11 til 0,19 for DP, hvilket gør analyseproceduren præcis inden for det undersøgte område (tabel 2).

3.1.5. Specificitet

Den utvetydige vurdering af den pågældende analysand fra en blanding af komponenter som urenheder, nedbrydningsprodukter og matrixkomponenter blev betegnet som specificitet . I denne undersøgelse blev specificiteten af både DP og RC bestemt på grundlag af en kromatografisk undersøgelse af prøveopløsningernes toprenhed. En top blev kun betragtet som spektralt homogen, dvs. fri for coelution, når vinklen for toprensning var mindre end tærskelværdien. Undersøgelsen viste, at toprensningsvinklen for RC og DP var henholdsvis 0,129 og 0,217, og toprensningstærsklen var henholdsvis 0,337 og 0,411 (tabel 3). Det blev derfor konkluderet, at de respektive toppe var spektralt homogene, fri for medfølgende urenheder og specifikke for den samtidige analyse af både RC og DP.

3.1.6. Robusthed

Robusthed blev normalt defineret som en analyseprocedures evne til at forblive upåvirket ved indførelse af små, men bevidste variationer af de procedureparametre, der er anført i proceduredokumentationen, og som giver en indikation af dens stabilitet under regelmæssig analyse. Den nuværende metodes robusthed blev undersøgt på grundlag af variationer i analytikerens, instrumenternes og opløsningens stabilitet og på grundlag af forskellige opbevaringsbetingelser. Resultaterne blev fundet inden for tolerancegrænserne (tabel 5).

Den nuværende metode viste sig at være robust til den samtidige kvantificering af RC og DP (tabel 5) ved koncentrationer så lave som 6,64 μg-mL-1 for RC og 1.89 μg-mL-1 for DP (tabel 2).

4. Konklusion

Den omvendte fase højtydende væskekromatografiske teknik udviklet i den aktuelle undersøgelse var enkel med hensyn til prøveforberedelse og analyse, følsom og selektiv til kvantificering af både resorcinol og dexpanthenol samtidigt, og præcis og nøjagtig til deres samtidige kvantificering fra en kompleks matrix. Metoden er blevet valideret med hensyn til nøjagtighed, præcession, linearitet og følsomhed i overensstemmelse med ICH Q2(R1)-retningslinjerne. Den respektive retentionstid for DP og RC var 3,19 minutter og 7,2 minutter. Toppene var godt opløst fra hinanden og andre tæt eluerende toppe. Den nuværende metode er således egnet til rutineanalyse, stabilitetstest og samtidig kvantificering af RC og DP fra forskellige formuleringer, der er tilgængelige på markedet.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.

Akkreditering

Forfatterne takker alle medlemmer af R&D-sektionen for deres venlige samarbejde og støtte. Forfatterne takker også ledelsen og bestyrelsesmedlemmerne for deres uvurderlige støtte og opmuntring.