Promotorer styrer bindingen af RNA-polymerase og transkriptionsfaktorer. Da promotorregionen styrer transkriptionen af et målgen, bestemmer den derfor tidspunktet for genekspression og definerer i vid udstrækning mængden af rekombinant protein, der vil blive produceret. Mange almindelige promotorer, f.eks. CMV-, EF1A- og SV40-promotorer, er altid aktive og betegnes derfor som konstitutive promotorer. Andre er kun aktive under bestemte omstændigheder. I dette indlæg vil vi diskutere inducerbare promotorer, som kan skiftes fra en OFF-tilstand til en ON-tilstand, og hvordan du kan bruge dem i din forskning. Når du er færdig med dette indlæg, kan du tjekke vores opfølgende indlæg om repressible promotorer.

Hvordan reguleres inducerbare promotorer?

Inducerbare promotorer kan reguleres ved positiv eller negativ kontrol.

Positiv inducerbar

I OFF-tilstanden er promotoren inaktiv, fordi aktivatorproteinet ikke kan binde. Når en inducer binder sig til aktivatorproteinet, kan aktivatorproteinet binde sig til promotoren, slå den til og starte transkriptionen.

Negative inducerbare

I OFF-tilstanden er promotoren inaktiv, fordi et bundet repressorprotein aktivt forhindrer transkription. Når en inducer binder repressorproteinet, fjernes repressorproteinet fra DNA’et. Når repressorproteinet er fraværende, er transkriptionen tændt.

Typer af inducerbare promotorer

Kemiske stoffer, temperatur og lys er alle eksempler på faktorer, der kan føre til induktion af en promotor. Nedenfor finder du en kort beskrivelse af disse tre typer af inducerbare promotorer samt eksempler på hver type. Mange af disse promotorsystemer er tilgængelige hos Addgene!

Kemisk inducerbare promotorer

Kemisk regulerede promotorer er blandt de mest almindelige inducerbare promotorer. Det positivt inducerbare tetracyclin ON-system (Tet-On), et alsidigt værktøj, der er udviklet til brug i prokaryoter og eukaryoter, fungerer via direkte aktivering. I dette system er aktivatoren rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator) normalt inaktiv og kan ikke binde tetracyclinresponselementerne (TRE) i en promotor. Tetracyclin og dets derivater tjener som inducerende stoffer for at muliggøre promotoraktivering.

En af de mest almindeligt anvendte prokaryote promotorer er den negative inducerbare pLac-promotor. Denne promotor kræver fjernelse af lac-repressoren (lacI-protein), for at transkriptionen kan aktiveres. Ved tilstedeværelse af laktose eller laktoseanalog IPTG undergår lac-repressoren en konformationsændring, der fjerner den fra lacO-stederne i promotoren og ophører med at undertrykke målgenet. Et forenklet lac-inducerbart system findes i mange bakterielle ekspressionsvektorer.

Negativ inducerbar promoter pBad er en anden populær prokaryote promoter, der ofte anvendes til bakteriel proteinrensning. Når arabinose er fraværende, binder det regulerende protein AraC O- og I1-steder opstrøms for pBad og blokerer transkriptionen. Tilsætning af arabinose får AraC til at binde I1- og I2-stederne, så transkriptionen kan begynde. Ud over arabinose kan cAMP i kompleks med cAMP-aktivatorprotein (CAP) også stimulere AraC-binding til I1- og I2-stederne. Supplering af cellevækstmedier med glukose mindsker cAMP og undertrykker pBad, hvilket mindsker promotorlækage.

Andre eksempler på kemisk inducerede promotorer omfatter positivt inducerbare alkohol- og steroidregulerede promotorer, der almindeligvis anvendes i planteforskning.

Promoter-subtype	Promoter-eksempel	Activator	Addgene Plasmid/Kit
Alkohol-reguleret	AlcA-promotor	AlcR	pGGA008 (AlcA) og pGGC011 (AlcR) fra rød flamme GreenGate-kit
Steroid-reguleret	LexA-promotor	XVE (syntetisk)	pFZ19 (gul flamme)

Temperaturinducerbare promotorer

Temperaturfølsomme ekspressionssystemer er typisk mindre lækagefølsomme end kemisk inducerede promotorer; De viser næsten ingen ekspression ved almindelige temperaturer, men kan induceres ved varme- eller kuldeeksponering. Som eksempler kan nævnes de varmechok-inducerbare Hsp70- eller Hsp90-afledte promotorer, hvor et gen efter eget valg kun udtrykkes efter eksponering for et kortvarigt varmestød. I tilfældet med Hsp70 frigør hedeslaget hedeslagsfaktor 1 (HSF-1), som efterfølgende binder sig til hedeslagselementer i promotoren og derved aktiverer transkriptionen. Addgene-depoterne har udviklet varmestød-inducerbare Cre og Cas9 til nem genomteknik i arter som C. elegans og Drosophila.

Lysinducerbare promotorer

Lys er en anden måde at aktivere genekspression på, og tokomponentsystemer, der anvendes i syntetisk biologi, bruger lys til at regulere transkriptionen. Rød flammeplasmidet pDawn indeholder det blålysfølsomme protein YFI. Når lyset er fraværende, fosforylerer YFI FixJ, som binder sig til FixK2-promotoren for at inducere transkription af fage-repressoren cI. Repressor cI hæmmer transkriptionen fra phagepromotoren pR og forhindrer dermed ekspression af et reportergen. Når der er lys til stede, er YFI inaktiv, hvilket forhindrer syntese af repressor cI og tillader transkription af reportergenet at finde sted. Addgene har også gul flamme lysregulerede tokomponentsystemer designet af Tabor-laboratoriet.

Hvilken inducerbar promotor er den rigtige for mig?

Her er en liste over nogle vigtige variabler, der skal overvejes, når man vælger en inducerbar promotor.

Eksperimentelt system

Da transkriptionsmaskineriet er forskelligt mellem celletyper eller organismer, er promotorer ligeledes variable. Bakterielle promotorer fungerer kun i prokaryote celler og typisk kun i den samme eller nært beslægtede art, som de stammer fra. På samme måde kræver de forskellige eukaryote celletyper (pattedyr, gær, planter osv.) unikke promotorer, og der er meget lidt krydsoverførsel. Induktionsmekanismen skal også være kompatibel med dit eksperimentelle system.

Lækkerhed

Hvis du udtrykker et gen, der kan være giftigt, er det vigtigt, at din inducerbare promotor ikke er for lækker. For inducerbare prokaryote promotorer er pLac kendt for at være lidt utæt, og pBad er sandsynligvis en bedre mulighed, da ekspressionen kan undertrykkes af glukose. Temperaturinducerbare promotorer er også kendt for deres lave lækagelighed.

Inducerbarhedsniveau

Hvor meget ønsker du at inducere transkription af dit målgen? Styrken af inducerbare promotorer kan variere meget. Hvis du er på udkig efter høj inducerbarhed, kan Tet-On-systemet være et godt valg, da det er dokumenteret at inducere transkription >1.000 gange, når det aktiveres.

Lag tid

Den tid, der er nødvendig for at inducere en given promotor, varierer. Promotorer, der kun kræver tilføjelse af en ekstern inducer, som f.eks. Tet-systemer, kan aktiveres meget hurtigt. I modsætning hertil vil promotorsystemer, der kræver transkription af en repressor/inducer, have en højere forsinkelsestid på grund af den tid, der er nødvendig for transkription/translokation.

Meget stor tak til Nicole Zurcher, der har bidraget til at skrive denne artikel.

Udvendige ressourcer på Addgene-bloggen:

• Plasmider 101: Promotorregionen
• Plasmider 101: Cre-lox
• Lys-switchable tokomponent-systemer til E. coli
• Browse andre blogindlæg fra vores Plasmider 101-serie