Abstract

本研究は、市販のヘアケア製剤からデキスパンテンとレゾルシンを同時に定量することを提案するものである。 デキスパンセノールは、美容効果や活性化効果、修復効果や滑らかさをもたらすことから、パーソナルケア製品に有効成分として含まれることが多い。 一方、レゾルシンは、主に頭皮の脂漏性皮膚炎の治療薬として処方されています。 レゾルシンの毒性による副作用のため、皮膚科製剤への使用は制限されています。 したがって、これら2つの成分を同時に推定する正確な定量技術は、製剤産業が製品の品質を正確に分析するために有用である。 本研究では，C18カラムとpH=2.8のリン酸塩緩衝液を用いた高速液体クロマトグラフィー技術を開発し，グラジエント溶出を行った。 移動相の流速は0.6 mL/分，検出波長はデキスパンセノールが210 nm，レゾルシノールが280 nmであった。 レゾルシンは10.34 μg-mL-1から82.69 μg-mL-1（）、デキスパンセノールは10.44 μg-mL-1から83.50 μg-mL-1（）の範囲の濃度を持つ5つの溶液を用いて直線性試験を実施したところ、レゾルシンは10.34 μg-mL-1（）、デキスパンセノールは10.44 μg-mL-1（）でした。 本法はICH Q2(R1)ガイドラインに基づきバリデートされています。 本法は，試料調製が容易であること，正確性，精度（日内および日間）が高いことから，これら2成分を含むあらゆるパーソナルケア製品および皮膚科製剤からデキスパンセノールおよびレゾルシノールを同時に定量するために適した方法であると考えられます。

1. はじめに

デキスパンテンコール (DP) は、D-パントテン酸のアルコール性類似物質です。 化学的には、2,4-ジヒドロキシ-N-(3-ヒドロキシプロピル)-3,3-ジメチル-1-ブタンアミドで、美容効果、活性化効果、修復効果、滑らかさのために、多くのビタミンB複合体の補助食品や化粧品（クリーム、軟膏、ローションなど）に有効成分として含まれます。 DP は皮膚から吸収され、コエンザイム A の生合成の前駆体である活性型パントテン酸（ビタミン B5）に変換される。 パントテン酸は、その欠乏が皮膚の炎症、皮膚炎、髪の色素沈着、成長阻害などのさまざまな種類の疾患につながる可能性があるため、「抗ストレスビタミン」ともみなされます。 皮膚科の製剤には、通常2〜5％の濃度で配合される。 その修復、滑らかな特性、抗皮膚炎や色素沈着特性のために、それはしばしばヘアケア製品やいくつかのビタミン製剤で使用されています。 アセイン、脂漏性皮膚炎、湿疹、乾癬、その他の皮膚疾患の治療など、多くの医薬品に応用されています。 また、ヘアカラー剤にも使用されています。 しかし、この分子は、長期使用または大量投与で副作用の数を持っている。 RCの長期的な使用は、甲状腺機能低下症を引き起こす人間の甲状腺に可逆的な影響をもたらすことが研究で示されている。

化粧品や医薬品には、RCとDPが賦形剤または有効成分として含まれていますが、このような製剤からRCとDPを定量する方法については、ほとんど報告されていません。 しかし、そのような製剤からRCやDPを定量する方法はほとんど報告されていません。 また、RCの定量法については、ほとんどが分光光度法であり、クロマトグラフィーによる定量法はほとんど報告されていない。 私たちの研究室で行われた別の研究では、液体クロマトグラフィーを用いたアイソクラティック溶出法を用いて、市販のヘアケア製品から RC のみを定量する技術を開発しました。 しかし、この方法は、このような製剤からのDPの定量には適していないため、この新しい技術の開発に着手することになった。 DPについては、超臨界流体クロマトグラフィーによる有効な方法が1つだけ報告されています。 この方法は、化粧品製剤中のパンテノールD型とL型のラセミ混合物中の活性D型を、質量分析検出器を用いて定量するものである。 本研究では、グリセリン、エタノール、ビオチン、ケラチン加水分解物、ヒアルキルHBU、ニコチン酸、ポリビニルピロリドンからなる複合マトリックスの存在下で、市販のヘアケア製品からDPとRCの両方を同時に定量する簡単、迅速、正確、かつ有効な手法を提示するものである。

2. 材料と方法

Dexpanthenol (DP) standard (purity 99.65%) and resorcinol (RC) standard (purity 99.98%) は Sigma Aldrich India Ltd. から購入しました。 DPとRCを含むヘアケア製剤で、バッチ番号HV1124、製造日2015年2月、有効期限2017年7月のものを代表的な市販製剤として試験に使用した。 クロマトグラフィーグレードの溶媒は、Spectrochem India Limitedから購入した。 長さ100mm、内径4.0mmのC18カラムをWaters Limited（Waters MA、USA）から購入した。 分析に使用した試薬はすべてMerck India Limitedから購入した

2.1. 装置およびクロマトグラフィー条件

定量化の目的でWaters Alliance Separation Module (Waters, USA) quaternary gradient systemとWaters 2489 dual lambda absorbance detectorを使用しました。 分析は、Empower 3 ソフトウェア (Waters, USA) を用いて行いました。 分析には、長さ100 mm、内径4.0 mm、粒子径5 μm、グラジエント溶出流量0.6 mL/minの逆相Waters C18 カラム（Waters, USA）を使用した。 移動相は、ろ過・脱気した5.4 mMリン酸緩衝液（pH = 2.8）とアセトニトリル（ACN）を表1に示す割合で組み合わせました。

分析は常温で、注入量は20μLで実施しました。 検出波長はDPが210 nm、RCが280 nmであった。 標準溶液および試料溶液は、クロマトグラフィー分離前に0.2 μmのメンブレンフィルター (Pall Life science, India) で濾過した

2.2. 標準溶液および試料溶液の調製

2.2.1. 標準溶液

RCおよびDPの標準溶液は、51.68 mgのRC（溶液A）および52.19 mgのDP（溶液B）を100 mLの希釈液（90%緩衝液および10%アセトニトリル）に溶解し、2つの別々の清潔で乾いたメスフラスコに超音波を使用して調製しました。 溶液 A は 10.34 μg-mL-1 から 82.69 μg-mL-1 の範囲に、溶液 B は 10.44 μg-mL-1 から 83.50 μg-mL-1 の範囲に希釈して分析に用いた（表 1）。 ピーク面積-濃度曲線を作成し（RCは図1（a），DPは図1（b）），本法の直線性の判定に使用し，定量目的にも同様に使用した。 結果はRCおよびDPについて、それぞれTable 2(a) および(b) に示した。 曲線あてはめの目的は、最小二乗法にしたがって行われた。

2.2.2. サンプル溶液

サンプル溶液の調製は、グリセリン、エタノール、ビオチン、ケラチン加水分解物、ヒアルキルHBU、ニコチン酸、ポリビニルピロリドンなどの多くの妨害物質がマトリックス内に存在する場合には重要であった。 しかし、本研究では、通常の分析に非常に適したシンプルなシングルステップの試料調製法に従って、本法を最適化しました。 2 mLの製剤を正確にピペッティングし、清潔で乾燥したメスフラスコに移し、移動相で25 mLに希釈しました。 この溶液を0.2 μmのメンブランフィルターでろ過した後、クロマトグラフィーシステムに注入しました。 メソッドバリデーション

高速液体クロマトグラフィーによるRCとDPの同時定量は、外部校正法に従って実施されました。 分析法のバリデーションは、正確性、精度、直線性、範囲、頑健性に基づいて行われた。 また，提案した分析法の信頼性と精度は回収試験に基づいて決定された。 試料溶液に標準原液を3段階（RCおよびDPをそれぞれRA，RBおよびRC，DA，DBおよびDCと表示し，測定値の80％，110％および120％）で添加し，その回収率を測定した。 また，標準溶液を 6 回繰り返し注入して測定した結果，本測定 法の再現性が確認された。 RCは10.34 μg-mL-1～82.69 μg-mL-1，DPは10.44 μg-mL-1～83.50 μg-mL-1の濃度範囲で標準直線性曲線を作成し，直線性を確認した（図 2）。 定量の目的でも同じ曲線が使用されました。 日内精度は，高濃度域（RC：41.34 μg-mL-1，DP：41.75 μg-mL-1）で同日および別日に6回注入して算出し，日間精度としました。 また，ピーク純度試験により，本法の特異性を評価しました。 この目的のために，前述のUV検出器の代わりにフォトダイオードアレイ（PDA）検出器を使用し，その他のクロマトグラフィー条件は変更しなかった。 定量下限（LOQ）および検出下限（LOD）は、他の場所に記載されている手法に従って決定されました。 メソッドの耐久性は、異なるメーカーの装置で実験を行うことによって決定されました。 移動相の組成 (±5%) やpH (±0.1%) などのクロマトグラフィー条件をわずかに変更し、メソッドの頑健性を検討した。

各段階で得られた結果は、Sigma plot software (Version 8.02 SPSS Inc..) に基づいて統計解析を行いました。 USA）およびMS Excel 2007に基づいて統計解析を行った。 データは反復測定で記録し、反復測定の平均±標準偏差で表示しました。

3 結果と考察

分析の平均実行時間は28分で、サンプル溶液中の平均保持時間はRCが数分、DPが数分でRCとDPは数分の差がありました。 標準クロマトグラムおよび試料クロマトグラムにおいてRCとDPの間に十分な分離が認められ，試料クロマトグラムでは密接に溶出するピークが十分な分離を示した（図3および図4）。 これは，市販のヘアケア製品から両者を同時に定量する技術として，おそらく初めて報告されたものです。 そこで，210 nmと280 nmを同時にスキャンするデュアルラムダ吸光光度検出器を用いて分析が行われた。 各成分のクロマトグラフィー純度は，対象となる各成分について PDA 検出器を用いて分析した。 RC と DP のピーク純度角はそれぞれ 0.129 と 0.217 であり，ピーク純度閾値はそれぞれ 0.337 と 0.411 であった。 このように、分析対象物のピークは対称的で純粋、かつスペクトル的に均一であり、サンプルのクロマトグラムにおいてそれぞれの分析対象物のピーク間に十分な分解能が存在する（図3（b）および図4（b））。

3.1. 開発した方法の検証

RCの定量はピーク面積で、DPの定量はピーク高さで実施しました。 分析方法はUSPおよびICH Q2（R1）ガイドラインに準拠し，バリデーションを実施しました。 3.1.1.各パラメータの検討は以下の通りです。 システム適合性

分析を行うためのクロマトグラフィーシステムの適合性は、システム適合性に基づいて検討されました。 これは通常、カラム効率、分離能、容量係数、テーリングファクターで表された。 通常、「」の文字で示される理論段数は、ピークのシャープネスを示す指標であるカラム効率を定義するもので、微量成分の検出には重要であった。 ピーク分解能または分解能係数「」の測定は、密接に溶出する化合物が互いによく分離されていること、システムの一般的な分離能を確保すること、さらに分析対象物のピークに対して内部標準がよく分離されていることを確認するために実施されました。 容量係数「」は、固定相と移動相の間の分析対象物の質量分布に対する指標であった。 ピークの非対称性は通常、シンメトリーファクターまたはテーリングファクターで表現された。 完全に対称なピークには1が割り当てられ、ピークのテーリングが増加するにつれて同じ値が増加します。 完全に対称なピークに対してその値は1であり、テーリングが顕著になるにつれて同じように増加する。 結果は、理論プレート（RCとDP）、容量係数（RCとDPは1.32）、ピーク非対称性、テーリング係数（RCとDPは0.56）としてまとめた（Table 3）。

3.1.2. 直線性及び範囲

メソッドの直線性を検討するため、RCは3.08 μg-mL-1～24.67 μg-mL-1、DPは10.44 μg-mL-1～83.50 μg-mL-1 の濃度範囲の標準溶液を使用しました。 分析で得られた結果を用いて、直線性曲線を作成した。 このようにして得られた曲線は、RCの回帰係数と式、DPの回帰係数と式で直線であることがわかりました（図2）。 直線性曲線を用いて求めた検出限界（LOD）および定量限界（LOQ）は、それぞれRCで2.19 μg-mL-1および6.64 μg-mL-1、DPで0.62 μg-mL-1および1.89 μg-mL-1となりました（Table 3）。 この結果は、検討中の分析範囲における技術の感度を説明するものでした。 精度

精度は、その手順で得られた試験結果の真値に対する近さの尺度であった。 検討中の濃度範囲における手順の精度を確立することが必要である。 本研究では、回収率試験に基づいて精度を分析した。 DPとRCについて，それぞれ計算上の測定濃度の80%，110%，120%の濃度範囲の溶液を調製した。 これらの溶液は，既知量の標準溶液 (A液およびB液) をそれぞれの試料溶液に添加することで調製された。 その結果，平均回収率は 100.28%，% RSD は RC で 0.82，DP でそれぞれ 100.02%，0.48 でした（Table 4）。 その結果，RCは100.28%，RSDは0.82，DPは100.02%でした。

3.1.4. Precession

この研究では、開発した技術の再現性と中間的な歳差のような一連の測定値の標準偏差または相対標準偏差に基づいて歳差を確立しました。 再現性の検討では、試験濃度100%の試料溶液を6種類調製し、検討中の分析方法を用いて分析した。 同じ試料溶液を3日間連続して注入し、得られた結果を中間才差の測定に使用した。 その結果，日内変動は0.19%，日間変動はRCのみ0.19%から0.21%，DPは0.20から0.11から0.19となり，本分析法は検討範囲において正確であることがわかりました（Table 2）。 特異性

不純物、分解物、マトリックス成分などの混合物から分析対象成分を明確に評価することを特異性と呼びます。 本研究では、DPおよびRCの特異性は、試料溶液のクロマトグラフィーピーク純度調査に基づいて決定された。 ピーク純度角が閾値以下であれば，スペクトルが均一である，すなわち共溶出がないピークとみなすことができる。 その結果，RCとDPのピーク純度角はそれぞれ0.129と0.217，ピーク純度閾値はそれぞれ0.337と0.411となった（表3）。 したがって、それぞれのピークはスペクトル的に均一であり、共存する不純物がなく、RCとDPの同時分析に特異的であると結論付けられました。 堅牢性

堅牢性は、通常、分析手順が、手順書に記載された手順パラメータの小さいが意図的な変動を導入しても影響を受けず、通常の分析中にその安定性を示す能力として定義されます。 本手法の頑健性は、分析者、装置、溶液の安定性のばらつき、および保存条件のばらつきに基づいて検討された。 その結果、許容範囲内であることが確認されました（表5）。

RCとDPの同時定量（表5）において、RCは6.64μg-mL-1、DPは1.0μg-mL-1と低濃度で本法はロバストであることが確認されました。また，DPは1.89μg-mL-1（Table 2）でした。 結論

今回開発した逆相高速液体クロマトグラフ法は，試料調整と分析が簡単で，レゾルシノールとデキスパンセノールを同時に定量するための感度と選択性，複雑なマトリックスからの同時定量における精度と正確性を備えていることが確認されました。 本法は，ICH Q2(R1)ガイドラインに基づき，精度，前処理，直線性，感度の面でバリデートされています。 DPとRCの保持時間はそれぞれ3.19分と7.2分であった。 また，DPとRCの保持時間はそれぞれ3.19分と7.2分であり，各ピークは互いに分離し，他の溶出ピークとも良好に分離していました。

利益相反

著者らは本論文の発表に関して利益相反がないことを宣言する。

謝辞

著者らはR&Dセクションのすべてのメンバーの協力と支援に感謝する。 また，経営陣と役員の方々には，多大なご支援とご鞭撻をいただいた。