Appendice A: Ulteriori approfondimenti sull’organizzazione spaziale della crista e delle cellule ciliate

La forma globale delle criste varia con le specie. È stata descritta per gli anamnioti (pesci e anfibi), e per gli amnioti (rettili, uccelli, mammiferi).

Nei pesci, la crista di tutte le SCC è a forma di sella e stretta al centro. Per gli SCC verticali, la crista è più larga in corrispondenza delle due componenti del confine (chiamato planum semilunatum). Nelle rane, le criste delle SCC verticali hanno una forma a manubrio, con una superficie arcuata prominente nel suo centro, ma la crista del canale laterale ha una singola zona recettoriale a forma di clava situata ad una estremità. Da questa zona recettoriale allargata, una singola massa cupulare si proietta lungo la parete per raggiungere l’apice, e una porzione un po’ più sottile nasce dal resto della zona recettoriale della crista e completa la maggior parte della cupula (Hillman 1974).

Negli amnioti, per esempio nelle razze, nelle lucertole, nelle tartarughe, nei piccioni, nella maggior parte dei roditori (topo, ratti, gerbillo ma non cincillà), nei gatti, nelle scimmie e negli esseri umani, le criste dei canali verticali (posteriore e anteriore) possono avere la forma di un manubrio. Presentano due emicristae, ciascuna con una zona centrale, separate da un septum cruciatum (Fig. 2; Lindeman 1969). In questo caso, la cupula si estende dalla base del recettore come due masse arcuate collegate attraverso il centro da una regione più sottile. Al contrario, il canale orizzontale possiede in generale una sola zona centrale. Le variazioni morfologiche tra SCC orizzontali e verticali non sono sorprendenti; i canali orizzontali sono apparsi più recentemente nell’evoluzione, e utilizzano espressioni geniche diverse per il loro sviluppo. Per l’SCC laterale, la depolarizzazione degli HC avviene quando la forza viene esercitata verso l’utricolo, ma per i canali verticali, al contrario, la depolarizzazione avviene quando la forza viene esercitata verso il dotto (Fig. 2).

Studi morfologici effettuati da Landolt et al. (1972) sui piccioni, hanno evidenziato che la geometria superficiale delle cristae delle ampolle membranose anteriore e posteriore è significativamente diversa da quella dell’ampolla membranosa laterale. Visto dall’alto, il contenuto delle ampolle associate ai dotti verticali ricorda una croce. I bracci più corti di questa croce sono costituiti da due protuberanze, le eminentiae cruciatae, e l’umbone tra di esse, il torus septi. Così, ci sono morfologicamente ‘due cristae’ all’interno di ogni ampolla. Ciascuna di queste “due cristae” è a forma di sella, ma la crista ampullaris dell’ampolla membranosa laterale è una cresta a forma di V che attraversa l’asse corto del lume dell’ampolla membranosa, come un catenoide. Tuttavia, nelle tre ampolle, la crista ampullaris mostra una simmetria bilaterale su un piano mediale al toro, e un’altra simmetria bilaterale sul piano trasversale mediale che è parallelo alla cupola (Fig. 2, pannello c).

La crista ampullaris raggiunge un terzo dell’altezza dell’ampolla e contiene il neuroepitelio, i vasi sanguigni e le fibre nervose. Il neuroepitelio è costituito principalmente da cellule ciliate e da cellule di sostegno che sono in gran parte responsabili delle proprietà biomeccaniche della crista e delle proprietà reologiche del gel nella cupula; le cellule adiacenti all’epitelio sensoriale contribuiscono anche alla struttura del gel (Lindeman 1969; Dohlman 1971).

Le cellule ciliate sulla crista

Negli amnioti, esistono almeno due diversi tipi di cellule ciliate (HC): le cellule di tipo I sono avvolte dai dendriti dei calici dei neuroni afferenti, sul lato interno dell’epitelio della crista, ma le cellule di tipo II sono contattate da terminazioni bouton (Wersäll 1954, 1956). (Si noti che la maggior parte dei neuroni afferenti nei mammiferi sono dimorfici, contattando sia HC di tipo I che di tipo II). Tuttavia, il principale gradiente fisiologico è dato dalla posizione nell’epitelio, per esempio sulla crista, la maggior parte delle cellule fasiche sono al centro e quelle più toniche sono in periferia (Goldberg e Brichta 1998; Eatock e Songer 2011). Negli uccelli, le HC di tipo I sono limitate al centro della crista, ma nei mammiferi, le HC di tipo I si trovano ovunque, e nei primati, c’è una dominanza di cellule di tipo I su tutta la crista (cfr. Lysakowski e Goldberg 2008 sulla scimmia scoiattolo). Tuttavia, la crista dei mammiferi ha un’organizzazione concentrica con tre tipi di neuroni afferenti e la fisiologia e morfologia delle HC: un centro, una zona intermedia e una periferia.

La densità delle cellule ciliate non è uniforme sulla superficie della crista; è significativamente più alta alla periferia che al centro (Hillman 1974; Lindeman 1969). La differenza di densità tra il centro e la periferia è più marcata per le cellule di tipo I, mentre le cellule di tipo II sono distribuite più uniformemente tra il vertice e la periferia delle criste (Goldberg e Brichta 1998). I fasci di capelli sono più corti nella regione centrale che nelle regioni periferiche delle criste (cfr. anche Njeugna et al. 1996).

I fasci di capelli (HBs) delle HCs hanno una varietà di morfologie e fisiologie per tutti gli epiteli degli organi terminali vestibolari, della crista del canale o della macula dell’otolite (Brichta et al. 2002).

Le stereocilia di una HB sono inserite all’apice dell’HC in disposizione regolare, e sono interconnesse in almeno tre modi: connessioni basali, contatto laterale e collegamenti di punta, (Howard et al. 1988). È stato dimostrato (almeno per i movimenti vibratori) che la deflessione del fascio è sincrona e coerente (Kozlov et al. 2006).

Diversi studi hanno riportato l’inserimento del kinocilio nel guscio della cupula, e filamenti che formano veli e tubi, collegando le stereocilia allo spazio subcupulare (Suzuki et al. 1984; Rüsch e Thurm 1989).

Struttura della cupula

La cupula è stata descritta per la prima volta con precisione da Steinhausen (1933) come una sostanza gelatinosa che si estende al tetto dell’ampolla e alle sue pareti laterali.

Diverse teorie sono state proposte per la cupula. Zalin (1967) ha proposto che la cupula sia sospesa dal tetto dell’ampolla. Dohlman (1971) ha proposto che la cupula si muove come un pistone, e ha suggerito che il fluido dell’endolinfa circola sul tetto dell’ampolla, non lungo la crista, ma più tardi (1977, 1980) ha suggerito una visione diversa che l’endolinfa circola nello spazio subcupulare. Rüsch e Thurm (1989) hanno fornito argomenti a favore di una diversa composizione del fluido nell’antro della cupula (Muller 1999).

Nel pesce rospo, Yamauchi et al. (2001) hanno dimostrato che la cupula può staccarsi dal tetto, ma rimane attaccata al confine della crista.

Inoltre, Dohlman (1977, 1980) ha proposto che strutture rigide, come filamenti o tubi, collegano le stereocilia alla cupula. Tale struttura filamentosa è stata osservata anche da Suzuki et al. (1984), e Rüsch e Thurm (1989), Takumida (2001). Tuttavia, questa struttura potrebbe dipendere dalle differenze di specie. Per esempio Silver et al. (1998) hanno riportato l’assenza di tali strutture nel pesce rospo. L’ottimalità di un sottile spazio subcupolare per aumentare la sensibilità è stato dimostrato da Muller (1999).

Dal lavoro di Hillman e McLaren (1979), studiando le rane, e Silver et al. (1998), studiando il pesce rospo ostrica (opsanus tau), possiamo dedurre che il complesso cupula è composto da quattro parti (Fig. 3): ali laterali su entrambi i lati, pilastri centrali congiunti nel mezzo (che formano il guscio cupulare), e un antrum cupula vicino alla crista, riempito con gel isotropo, rinforzato con collagene che corre verticalmente (cfr. Hunter-Duvar e Hinojosa 1984 per i mammiferi). L’involucro cupulare è fatto di fibre di tessuto connettivo, densamente imballate e reticolate. Di conseguenza, Takumida (2001) ha distinto tra cupula in senso stretto (per l’involucro cupulare) e reticolo subcupulare (per l’antrum cupulare).

L’antrum cupulare contiene un mezzo acquoso in cui si proiettano i fasci di cellule ciliate (formati da stereocilia multiple e un singolo kinocilio), che nascono dalla superficie apicale delle cellule ciliate sensoriali (Hillman e McLaren 1979). Questo gel può essere privo di materiale, come nel pesce rospo (Silver et al. 1998), ma può anche essere pieno di strutture di connessione, come nella cavia (Takumida 2001). Nelle cavie, Wersäll (1956) ha descritto sottili canali verticali dove si trovano i fasci HC. Questo insieme di fibre connettive sottili e ciglia è stato chiamato da Takumida (2001) la rete subcupulare. Si tratta di una massa di materiale extracellulare altamente specializzato (Landolt et al. 1972; Silver et al. 1998).

Takumida ha proposto una relazione funzionale tra le cellule ciliate sensoriali e la cupula (Takumida 2001). Secondo la sua osservazione, la struttura isotropa altamente reticolata del guscio cupulare indica che questo strato potrebbe funzionare come una piastra rigida e distribuisce equamente le forze d’inerzia dalla grande massa dell’intera cupula a tutti i fasci di capelli sensoriali. Lo sforzo di taglio dovuto all’accelerazione relativa della cupola provoca uno sforzo di taglio della cupola stessa. L’energia proveniente dal movimento della cupola viene trasmessa ai peli sensoriali direttamente o indirettamente attraverso il reticolo subcupolare. Questa osservazione di Takumida è la base principale della nostra ipotesi di invarianza. Infatti, la funzione del sistema cupolare è di trasformare la deformazione tridimensionale della cupola in una flessione unidimensionale delle cellule ciliate, e noi interpretiamo l’ipotesi dell’equa distribuzione delle forze in Takumida come un’ipotesi di riduzione dimensionale da parte di un gruppo di simmetria a un parametro.

Modelli della cupola

Oggi ci sono prove sperimentali che la cupola si sposta come un diaframma quando è soggetta a un gradiente di pressione (Hillman e McLaren 1979; Yamauchi et al. 2001).

La teoria standard è che la cupola sia analoga a una membrana a tamburo (Landolt et al. 1972). Anche Van Buskirk (1976) ha modellato la cupula come una membrana elastica che abbraccia l’intera ampolla sotto forma di diaframma. (Per una revisione dei modelli di cupula, vedi anche McLaren e Hillman 1979; Hillman e McLaren 1979.)

Secondo gli esperimenti effettuati sulla cupula della rana toro, McLaren e Hillman (1979) e Hillman e McLaren (1979) suggeriscono che la base della cupula scivola sulla superficie della crista e taglia lo spazio subcupulare tra la crista e la cupula. Si noti che lo sforzo di taglio attraverso l’intera larghezza trasversale della crista è eccitatorio o inibitorio per tutte le cellule ciliate allo stesso tempo (Rabbitt et al. 2001), a seconda dello spostamento trasversale delle ali della cupula.

Kondrachuk et al. (1987) hanno dato un modello matematico delle variazioni nel tempo della cupula; in particolare, hanno discusso le proprietà di viscosità-elasticità della cupula per l’applicabilità di un modello di membrana. Altri (per esempio, Astakhova 1989, 1990) hanno considerato il sistema come composto da un pistone elastico (cupula) in un fluido viscoso (endolinfa).

Vega et al. (2008) hanno eseguito un confronto tra i due modelli, che ha dimostrato che la dinamica del comportamento cupulare sotto stimolazione periodica è equivalente per entrambi i modelli cupulari a pistone e a membrana.

Quindi, anche se il massimo spostamento cupolare si verifica vicino al centro geometrico dell’ampolla, la massima deformazione di taglio si verifica proprio al livello in cui i fasci di capelli sensoriali si proiettano nella cupola. Questo punto è stato sottolineato nel lavoro di (Muller 1999). Poiché è lo spostamento relativo tra le ciglia adiacenti che in ultima analisi porta al gating del canale di trasduzione, la tensione di taglio nella cupola sembra essere ideale per attivare le cellule ciliate. Per le rotazioni vibratorie della testa, la dinamica accoppiata del fluido nei canali e della cupola implica l’esistenza di una banda di frequenza critica in cui lo spostamento trasversale della cupola è proporzionale e in fase con la velocità angolare della testa (Wilson e Melvill Jones 1979; Rabbitt et al. 2001). In questa banda, la deformazione di taglio è proporzionale allo spostamento di volume a livello della cupola. Highstein et al. (2005) e Rabbitt et al. (2001) hanno fatto una simulazione di quel punto.

Ci sono prove sperimentali che la cupola (i) ha una certa rigidità e resiste alla deformazione dalla sua posizione di riposo, (ii) ha viscosità e resiste al tasso di variazione della deformazione dalla posizione di riposo, e (iii) ha un campo di deformazione spazialmente non uniforme (Damiano e Rabbitt 1996). La rigidità rotazionale \(K) in unità \(SI) è \(K = 7.1 \cdot 10^{-11}\) N m/rad (Grant e Van Buskirk 1976). La cupola copre completamente la sezione trasversale dell’ampolla. È una struttura relativamente spessa (un terzo dell’altezza, per esempio 0,15 mm di larghezza per 0,45 mm di altezza nell’axolotl, Vega et al. 2008), ma si assume che si deformi uniformemente attraverso lo spessore, un’assunzione restrittiva che si trova anche in Damiano e Rabbitt (1996). Questo è conforme al piano funzionale suggerito da Takumida (2001).

Nel nostro studio, abbiamo modellato il sistema cupula come un solido visco-elastico newtoniano disomogeneo, composto da quattro domini omogenei: le ali (o due pareti laterali), la cupula vera e propria (o due pilastri cupula), l’antrum cupula e la crista. L’incomprimibilità del gel nell’antrum è affermata da Selva et al. (2009); Yamauchi et al. (2001); Kassemi et al. (2005).

La maggior parte del presente studio riguarda l’antrum, visto come un idrogel (Selva et al. 2009). Quindi, non assumiamo l’omogeneità della cupola, ma assumiamo l’omogeneità nella parte inferiore della cupola (antrum) in prossimità della crista. Questa ipotesi è esplicitamente fatta dalla maggior parte dei modelli (Selva et al. 2009; Vega et al. 2008; Damiano 1999). Poiché lo spostamento nella cupola è una questione di pochi micrometri, spesso una dozzina di nanometri, le equazioni del nostro modello corrisponderanno alla legge lineare di Hooke.

Appendice B: Analisi e dimostrazioni

Il tensore \(\sigma ^{ij}) è simmetrico (cioè, \sigma ^{ij}=sigma ^{ji}\ per qualsiasi coppia \(i,j\) di indici).

Facciamo l’ipotesi che l’antrum cupula abbia un modello visco-elastico lineare, che è incomprimibile.

Sull’epitelio sensoriale la condizione limite è un’espressione dell’equilibrio delle forze alla frontiera tra ogni compartimento, cioè tra le fibre della cupola e l’antrum della cupola e tra l’antrum della cupola e la crista:

La dinamica è descritta dalla legge di Newton, equiparando la divergenza del tensore \(\sigma ^{ij}\ con la somma delle forze applicate e l’accelerazione covariante dello spostamento \(u^i\), che è la forza inerziale. Questo è espresso dalle Eqs. (17) e (19) nelle posizioni di equilibrio, che si raggiunge al massimo spostamento. Si noti che la spesa totale di energia dipende da questo caso.

L’altra equazione è l’Eq. (18) che esprime l’incomprimibilità.

Durante i movimenti, la differenza di pressione esercitata sulle pareti della cupola le sposta, generando variazioni della densità di energia interna all’antro:

La variazione totale di energia cinetica è data dalla Eq. (21). Da ciò si deduce che la dissipazione di energia dovuta alla viscosità nella cupola è proporzionale all’integrale della norma quadrata del tensore \(\sigma \) per lo spostamento maggiore. L’espressione non sarebbe diversa per un fluido viscoelastico, con un effetto memoria o con un effetto di rilassamento. Le forze di taglio esercitate sull’epitelio crista sono la componente \(\sigma .\mathbf{n})^{i}=somma _j\sigma ^{ij}n_j\) lungo il vettore normale; la trasmissione di informazioni attraverso le HC implica che dia un contributo non nullo in questo integrale. Il calcolo del termine \(u_{13}\ sotto il nostro vincolo di invarianza mostrerà che la superficie totale di \(\varSigma \) deve essere minima se vogliamo minimizzare la perdita di energia.

Si noti che risultati simili dovrebbero essere ottenuti con la stessa prova per un modello Kelvin di solido visco-elastico, o per un modello Maxwell di fluido visco-elastico. Anche per i modelli non lineari il risultato potrebbe essere giustificato, perché all’equilibrio, per lo spostamento massimo, il sistema si avvicina bene a uno lineare. Tuttavia, per un modello non lineare, altre fonti di perdita di energia devono essere prese in considerazione.

Dalla statica alla geometria

Adottiamo le notazioni e le ipotesi della Sez. 2.

Le quattro equazioni di equilibrio:

Per l’operatore di Hodge \(*\), abbiamo

e

Quindi

Questo dà:

Quindi il coefficiente di \(\mathrm{d}x^1\mathrm{d}x^2\) in \(*mathrm{d}*\mathrm{d}\beta \) deve essere zero, il che dà la prima equazione:

E il coefficiente di \(\mathrm{d}x_2\mathrm{d}x_3\) dà la terza equazione:

Abbiamo un’altra equazione esprimendo che \(\mathrm{d}*\beta =0\). Dalla seguente formula:

la quarta equazione di equilibrio è:

Prova della Proposizione 1

Prova della Proposizione 3

Scriviamo l’Eq. (73) all’ordine uno in \(x_3\). I coefficienti \(g^{ij}) si ottengono per inversione della matrice \(g_{ij}):

Quindi, al primo ordine in \(x_3\), si ottiene

Ora scriviamo \(b\) per il terzo coefficiente in \(x_3\) di \(\beta ^{1}}), l’Eq. (73) all’ordine uno, può essere scritta

che dà il risultato su \(\beta \), quando si usa \(b_1^{1}+b_2^{2}=0\). Ma \(u_1=g^{11}beta ^{1}+g^{12}beta ^{2}}) quindi all’ordine \(3\) in \(x_3\) abbiamo:

che dà il secondo risultato.\(\quadrato \)

Prova della proposizione 4

La proposizione segue dalle definizioni raggruppando i termini.

Per esempio:

lo stesso per \(u_{22}) e \(u_{33}). Ora per i simboli misti:

E per l’ultimo:

che è

Da qui segue il risultato annunciato. \(\quadro \)

Prova del primo corollario della Proposizione 4

Abbiamo per ipotesi che la traccia di \(u_{ij}) sia zero, cioè \(u_1^{1}+u_2^{2}=0\), che dà all’ordine zero in \(x_3\):

ma avevamo già

Prova del secondo corollario della Proposizione 4

Segue dall’ipotesi che \(u^{13}) sia invariante per \(\parziale _1\). \(\quadrato \)

Prova della proposizione 5

Si noti che la minimalità implica anche che \(n^{0}_1.n^{0}_2=0\), quindi \(g_{12}) non ha componenti di ordine due.

Di conseguenza, all’ordine uno in \(x_3\), (Eq. 72) dà

dove \(c\) indica il coefficiente di \(x_3^{3}) in \(\beta ^{2}). Il risultato segue. \(\quadrato \)

Prova della proposizione 6

per cui

Sappiamo dalla proposizione 3 che

Tuttavia, dal secondo corollario della Proposizione 4, abbiamo \(\parziale _1b_{11}=0\), quindi:

Appendice C: Geometria. Superfici minime invarianti

Il nostro scopo era di provare le due affermazioni puramente geometriche usate per caratterizzare la forma della superficie crista dalla sua invarianza e dalla sua minimalità.

Prova della proposizione A

Integrando \(\sqrt{g_{22}}\), possiamo supporre che

Verifichiamo direttamente che

quindi

Inoltre, l’invarianza di \(g_{ij}}) implica

che dà per definizione dei simboli \(b_{ij}\):

L’asse e la velocità angolare sono dati dal seguente vettore:

In tutti gli altri casi verifichiamo che il vettore velocità angolare \(v\) è indipendente da \(x_2\).

Se calcoliamo la derivata di \(v\) per \(\parziale _1\), troviamo

Ma abbiamo \(\parziale _1A_2=0\), e

Dall’altra parte, calcolando il commutatore \(=A_1A_2-A_2A_1\), troviamo:

Questo implica le tre condizioni seguenti:

Insieme dicono precisamente che \(\parziale _2v=0\).

Che dà

Per avere una superficie minima, dobbiamo avere \(b_{\theta }^{\theta }+b_{y}^{y}=0}), cioè l’equazione differenziale

Tutte le soluzioni sono date dalla formula

dove \(a,y_0\) sono costanti reali positive qualsiasi. \(\quadrato \)

La dimostrazione del caso generale (ii) è più elaborata. Cominciamo usando l’Eq. (107) per calcolare direttamente \(g_1(x_2)\).

La prima equazione \(\parziale _2(b_{11}/g_1)=b_{22}parziale _2g_1\), può essere scritta

Con l’aggiunta dell’ipotesi di minimalità \(b_1^{1}+b_2^{2}=0\), questo dà

Così esiste una costante \(C_1\) tale che \(b_1^{1}=C_1/g_{11}}), che può anche essere espressa da