A promóterek az RNS-polimeráz és a transzkripciós faktorok kötődését szabályozzák. Mivel a promóter régió irányítja a célgén transzkripcióját, ezért meghatározza a génexpresszió időzítését, és nagymértékben meghatározza a termelődő rekombináns fehérje mennyiségét. Sok gyakori promóter, mint például a CMV, EF1A és SV40 promóterek, mindig aktívak, ezért konstitutív promótereknek nevezik őket. Mások csak bizonyos körülmények között aktívak. Ebben a bejegyzésben az indukálható promótereket tárgyaljuk, amelyek kikapcsolt állapotból bekapcsolt állapotba kapcsolhatók, és hogyan használhatod ezeket a kutatásodban. Ha végeztél ezzel a bejegyzéssel, nézd meg a represszibilis promóterekről szóló következő írásunkat.

Hogyan szabályozzák az indukálható promótereket?

Az indukálható promóterek szabályozhatók pozitív vagy negatív kontrollal.

Pozitív indukálható

A kikapcsolt állapotban a promóter inaktív, mert az aktivátorfehérje nem tud kötődni. Miután egy induktor kötődik az aktivátorfehérjéhez, az aktivátorfehérje képes kötődni a promóterhez, bekapcsolja azt és elindítja a transzkripciót.

Negatív indukálható

Az OFF állapotban a promóter inaktív, mert egy kötött represszorfehérje aktívan megakadályozza a transzkripciót. Amint egy induktor megköti a represszorfehérjét, a represszorfehérje eltávolodik a DNS-ről. A represszorfehérje hiányában a transzkripció bekapcsolódik.

Az indukálható promóterek típusai

A kémiai anyagok, a hőmérséklet és a fény mind olyan tényezők, amelyek egy promóter indukciójához vezethetnek. Az alábbiakban az indukálható promóterek e három típusának rövid leírását és példákat találsz mindegyik típusra. Számos ilyen promóterrendszer elérhető az Addgene-nél!

Kémiailag indukálható promóterek

A kémiailag szabályozott promóterek a leggyakoribb indukálható promóterek közé tartoznak. A pozitív indukálható tetraciklin ON (Tet-On) rendszer, egy prokariótákban és eukariótákban való felhasználásra kifejlesztett sokoldalú eszköz, közvetlen aktiválással működik. Ebben a rendszerben az rtTA (fordított tetraciklin-vezérelt transzaktivator) aktivátor általában inaktív, és nem képes megkötni a promóterben lévő tetraciklin válaszelemeket (TRE). A tetraciklin és származékai indukáló ágensként szolgálnak a promóter aktiválásának lehetővé tételéhez.

Az egyik leggyakrabban használt prokarióta promóter a negatív indukálható pLac promóter. Ez a promóter a lac represszor (lacI fehérje) eltávolítását igényli a transzkripció aktiválásához. Laktóz vagy laktózanalóg IPTG jelenlétében a lac-represszor olyan konformációs változáson megy keresztül, amely eltávolítja a promóteren belüli lacO-helyektől, és megszűnik a célgén repressziója. Egy egyszerűsített lac indukálható rendszer számos bakteriális expressziós vektorban megtalálható.

A pBad negatív indukálható promóter egy másik népszerű prokarióta promóter, amelyet gyakran használnak bakteriális fehérjetisztításhoz. Arabinóz hiányában az AraC szabályozó fehérje O és I1 helyekhez kötődik a pBad folyásiránnyal szemben, blokkolva a transzkripciót. Arabinóz hozzáadásával az AraC az I1 és I2 helyekhez kötődik, lehetővé téve a transzkripció megkezdését. Az arabinóz mellett a cAMP-aktivátor fehérjével (CAP) komplexben lévő cAMP is serkentheti az AraC kötődését az I1 és I2 helyekhez. A sejtnövesztő közeg glükózzal való kiegészítése csökkenti a cAMP-ot és elnyomja a pBad-ot, csökkentve a promóter szivárgását.

A kémiailag indukált promóterek további példái a növénykutatásban általánosan használt pozitív indukálható alkohol és szteroid szabályozott promóterek.

Promoter altípus	Promoter példa	Aktivátor	Addgene Plasmid/Kit
Alkohol-.szabályozott	AlcA promóter	AlcR	pGGA008 (AlcA) és pGGC011 (AlcR) a red flame GreenGate kitből
Steroid-szabályozott	LexA promóter	XVE (szintetikus)	pFZ19 (sárga láng)

Hőmérséklet által indukálható promóterek

A hőmérsékletérzékeny expressziós rendszerek általában kevésbé szivárognak, mint a kémiailag indukált promóterek; normál hőmérsékleten közel nulla expressziót mutatnak, de hő- vagy hidegexpozícióval indukálhatók. Ilyenek például a hősokk-indukálható Hsp70 vagy Hsp90-eredetű promóterek, amelyekben a kiválasztott gén csak rövid ideig tartó hősokknak való kitettséget követően fejeződik ki. A Hsp70 esetében a hősokk hatására felszabadul a hősokkfaktor 1 (HSF-1), amely ezt követően a promóterben lévő hősokkelemekhez kötődik, és ezáltal aktiválja a transzkripciót. Az Addgene letéteményesei hősokk-indukálható Cre- és Cas9-rendszert fejlesztettek ki az olyan fajok egyszerű genomszerkesztéséhez, mint a C. elegans és a Drosophila.

Fényindukálható promóterek

A fény egy másik módja a génexpresszió aktiválásának, és a szintetikus biológiában használt kétkomponensű rendszerek fényt használnak a transzkripció szabályozására. A vörös láng pDawn plazmid a kék fényt érzékelő YFI fehérjét tartalmazza. Fény hiányában az YFI foszforilálja a FixJ-t, amely a FixK2 promóterhez kötődve indukálja a fág represszor cI transzkripcióját. A represszor cI gátolja a fág promóter pR transzkripcióját, megakadályozva a riportergén kifejeződését. Fény jelenlétében az YFI inaktív, megakadályozza a represszor cI szintézisét, és lehetővé teszi a riportergén átírását. Az Addgene rendelkezik a Tabor laboratórium által tervezett sárga lángfény-szabályozott kétkomponensű rendszerekkel is.

Melyik indukálható promóter a megfelelő számomra?

Itt van egy lista néhány fontos változóról, amelyet figyelembe kell venni az indukálható promóter kiválasztásakor.

Kísérleti rendszer

Mivel a transzkripciós gépek sejttípusonként vagy szervezetenként különböznek, a promóterek is hasonlóan változatosak. A bakteriális promóterek csak prokarióta sejtekben működnek, és jellemzően csak abban az azonos vagy közeli rokon fajban, amelyből származnak. Hasonlóképpen, a különböző eukarióta sejttípusok (emlősök, élesztő, növények stb.) egyedi promótereket igényelnek, és nagyon kevés az átjárás. Az indukciós mechanizmusnak is kompatibilisnek kell lennie az Ön kísérleti rendszerével.

Leakiness

Ha olyan gént fejez ki, amely mérgező lehet, fontos, hogy az indukálható promóter ne legyen túlságosan leaky. Az indukálható prokarióta promóterek esetében a pLac köztudottan kissé szivárgó, és a pBad valószínűleg jobb választás, mivel az expresszió glükózzal elnyomható. A hőmérsékleten indukálható promóterek szintén alacsony szivárgásukról ismertek.

Indukálhatósági szint

Mennyire akarja indukálni a célgén transzkripcióját? Az indukálható promóterek erőssége nagyon eltérő lehet. Ha nagy indukálhatóságot keresel, a Tet-On rendszer jó választás lehet, mivel dokumentáltan >1.000-szeres transzkripciót indukál aktiváláskor.

Lag time

Az adott promóter indukciójához szükséges idő változó. Azok a promóterek, amelyek csak külső induktor hozzáadását igénylik, mint például a Tet-rendszerek, nagyon gyorsan aktiválódhatnak. Ezzel szemben a represszor/induktor átírását igénylő promóterrendszereknél a transzkripcióhoz/transzlációhoz szükséges idő miatt nagyobb a késleltetési idő.

Nagy köszönet Nicole Zurchernek, aki hozzájárult e cikk megírásához.

Kiegészítő források az Addgene blogon:

• Plazmidok 101: A promóter régió
• Plazmidok 101: Cre-lox
• Light-Switchable Two-Component Systems for E. coli
• Browse other blog posts from our Plasmids 101 series

.