Eredmények
Eredetileg kimutattuk, hogy a cikloheximid adása a pilokarpin SE indukciójának közvetlen közelében blokkolta a szupragranuláris MFS-t patkányokban – de nem akadályozta meg a spontán rohamok későbbi kialakulását és nem befolyásolta azok gyakoriságát. Ezek az eredmények először szolgáltattak közvetlen bizonyítékot a szupragranuláris MFS-nek a temporális lebeny epileptogenezisében játszott ok-okozati szerepe ellen. Ennek a disszociációnak az egyik lehetséges magyarázata az, hogy az epilepszia pilokarpin és kainát modelljeiben a rohamokat extrahippokampális források vezérelhetik. Valóban, a thalamus, az amygdala és a piriform kéreg relatív hozzájárulását a spontán rohamok kiváltásában ezekben a modellekben több tanulmány is jelezte.
E kérdés megoldására a következőkben a kaininsav kis dózisú intrahippocampalis alkalmazását alkalmaztuk. A cikloheximid itt is képes volt a legtöbb állatban teljesen blokkolni a szupragranuláris MFS-t, anélkül, hogy a spontán ictalis és interictalis EEG-események gyakorisága és intenzitása megváltozott volna. Arra a következtetésre jutottunk, hogy az intrahippokampális kis dózisú kainát modellben is, ahol a spontán rohamok nagyobb valószínűséggel indultak el az injektált hippokampuszban, a szupragranuláris MFS nem szükséges az ictalis események bekövetkezéséhez.
Mivel a kezdeti kísérletek során végzett elemzésünk nagy részében a kezdeti előidéző sérülés után 2 hónappal értékeltük az állatokat, ezután azt próbáltuk megvizsgálni, hogy a spontán rohamok hogyan befolyásolják a szupragranuláris MFS-et. Néhány, ezzel a témával kapcsolatos publikáció azt mutatta, hogy a gyakoribb rohamokban szenvedő állatoknál a szupragranuláris MFS intenzívebb, ami arra utal, hogy a szinaptikus reorganizációnak ez a formája valamilyen módon összefügg a rohamokra való nagyobb hajlammal (még ha nem is ez határozza meg, hogy kialakulnak-e rohamok vagy sem). Más kutatók azt állították, hogy a szupragranuláris MFS sűrűsége nem függ össze az élethosszig tartó rohamok teljes számával vagy a rohamok gyakoriságával (kísérletes vagy humán temporális lebeny epilepsziában), és sok szerző már nem tekinti az MFS-t szükséges vagy elégséges eseménynek a temporális lebeny epilepsziában. Emberi körülmények között azonban nincs befolyásunk a szövet háttérállapotára. A legtöbb kísérletes vizsgálatban pedig SE volt szükséges a rohamok kialakulásához – ahol nem kérdés, hogy a szupragranuláris MFS nagyrészt egy megelőző SE epizód tükörképe. Egy olyan kísérleti feltétel előállításával, amelyben a kezdeti SE-epizódból nem származott szupragranuláris MFS, meg tudtuk vizsgálni a későbbi spontán rohamok relatív hozzájárulását ehhez a szinaptikus átrendeződéshez. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a szupragranuláris MFS nem mutatott semmilyen összefüggést a spontán rohamok gyakoriságával, és úgy tűnt, hogy inkább a kezdeti sérülést követő időtől függ. Valóban, ilyen körülmények között a szupragranuláris MFS végül minden állatban kifejlődött, még ha sokkal lassabb ütemben is; továbbá nem tűnt robusztusabbnak azokban az állatokban, ahol a visszatérő spontán rohamok gyakorisága nagyobb volt.
A halántéklebeny epilepsziás betegek emberi szöveteiben a szemcsesejtek szétszóródásának leírása azt a feltételezést vetette fel, hogy a fejlődési változások állhatnak a későbbi epilepszia hátterében ezeknél a betegeknél. Annak kimutatása – először pilokarpin patkánymodellben, majd később kainátkezelt egerekben -, hogy felnőtt rágcsálókban is kialakulhat szemcsesejt-diszperzió, azt jelezte, hogy ezek a citoarchitetonikus változások a SE kezdeti, kiváltó epizódjának következményei is lehetnek. Az a későbbi kimutatás, hogy a dentate granulasejtek neurogenezise megnövekedett az SE után, bevezetett egy további lehetőséget – hogy az epileptogenezissel összefüggő hippokampusz-hálózat plaszticitása az újonnan született dentate granulasejtek által kialakított aberrált kapcsolatokból eredhet. Ezért megvizsgáltuk, hogy a cikloheximid befolyásolja-e a szupragranuláris MFS kialakulását a szemcsesejtek neurogenezisének blokkolásával. Nagy meglepetésünkre megfigyeltük, hogy a cikloheximiddel kezelt epilepsziás állatokban drámaian megnövekedett a sejtproliferáció a DG-ben. A SE indukciója a csak pilokarpinnal injektált állatokban 2-7-szeres növekedést eredményezett a dentát szemcsesejtek mitotikus rátájában, szemben a pilokarpin/cikloheximiddel kezelt állatok 5-30-szoros növekedésével. Feltételeztük, hogy az ilyen megnövekedett mitotikus ráták a cikloheximid által nyújtott védelemhez kapcsolódnak egy olyan sérülékeny prekurzor sejtpopuláció esetében, amely egyébként a pilokarpin által kiváltott SE után degenerálódna. Továbbá felvetettük, hogy az MFS és a szemcsesejtek neurogenezise nem feltétlenül kapcsolódik egymáshoz. Ez a disszociáció összhangban van azzal a megállapítással, hogy a pilokarpin-indukált SE-nek kitett állatok besugárzása lényegében megszüntette a dentát szemcsesejtek neurogenezisét, de nem akadályozta meg a mohaszálak átrendeződését a dentát molekuláris rétegben.
A hippokampusz szeletekben végzett teljes sejtes patch-clamp felvételek azt mutatták, hogy a szemcsesejtekben a spontán gerjesztő posztszinaptikus áramok amplitúdója és gyakorisága a kainát kezelés után idővel nőtt. Ez a megnövekedett gerjesztő szinaptikus bemenet korrelált a Timm-festés intenzitásával a belső molekuláris rétegben. Amikor a gátlást bikukulinnal csökkentettük a kainátkezelt állatokból származó szeletekben, a szemcsesejt-rétegben alkalmazott ketrecbe zárt glutamát villanófényes fotolízise epileptiform akciós potenciálkitöréseket idézett elő (ez a hatás nem volt megfigyelhető a kontroll patkányok szemcsesejtjeiben). Ezek az adatok alátámasztották azt a hipotézist, hogy a kainát által kiváltott szupragranuláris MFS a szemcsesejtek közötti aberráns gerjesztő kapcsolatok progresszív kialakulását eredményezi. Az elektrofiziológiai profilban a cikloheximid-kezelés hatására bekövetkező változások értékelésére in vitro elektrofiziológiát (extracelluláris felvételek) végeztünk 2 hónappal a pilokarpin-indukált SE után. A pilokarpingénnel és pilokarpingénnel/cikloheximiddel kezelt patkányok szeleteiben kiváltott potenciálok kis amplitúdójú polyspiking aktivitást (epileptiform válaszok) mutattak a CA1-ben és egy látszólag normális izolált populációs tüskét a DG-ben. Ami még fontosabb, hogy a pilokarpin és pilokarpin/cikloheximid állatokból származó szeletekben a DG nem különbözött az elektrofiziológiai rendellenességek tekintetében, még magas K+ vagy magas K+/bicucullin értékek mellett sem. A neo-Timm festődés elemzése, a várakozásoknak megfelelően, erős szupragranuláris MFS-t mutatott a pilokarpin injekciót kapott patkányokban és lényegesen kevesebb festődést a pilokarpin/cikloheximid patkányokban. Így az abnormális ingerületválaszok és a magas K+- vagy magas K+/bicucullin-indukált epileptiform aktivitások előfordulása nem függött a szupragranuláris MFS mértékétől.
Az egyik régóta fennálló kérdés az MFS kialakulásával kapcsolatban az SE állatmodelljeiben az, hogy a kihajtott mohás rostok új szinapszisokkal egészítik-e ki a dendriteket a molekuláris rétegben – vagy ezek a kihajtott rostok egyszerűen helyettesítik a (hiláris sejtdegeneráció miatt) megüresedett szinapszisokat. Valójában a témával kapcsolatos legtöbb tanulmány a hilus mohasejtek elvesztését – ami általában a szemcsesejtes mohasejtes rostok fő hilus célpontja – a szupragranuláris MFS elindításának fontos tényezőjeként jelölte meg. A pilokarpin által kiváltott SE cikloheximid jelenlétében a cikloheximiddel nem előkezelt patkányokhoz képest a sérült hilaris sejtek számának csökkenését eredményezte. A feltételezett mohasejtek, amelyeket kalcitonin-génnel kapcsolatos peptid (CGRP) immunhisztokémiával azonosítottak, 60 nappal az SE után egyik csoportban sem csökkentek szignifikánsan (mivel ez az eredmény látszólag ellentmondásban van a mohasejtek SE veszteségét jelző bizonyítékok túlsúlyával, feltételezzük, hogy a CGRP a mohasejtek egy alpopulációjának markere lehet). Míg a kontrolloknál a belső molekuláris rétegben CGRP-pozitív rostok (feltételezett mohasejtes axonok) erős sávja volt, és nem voltak neo-Timm-festett rostok, addig a pilokarpin kezelt patkányoknál nem voltak CGRP-rostok és erős neo-Timm-festés. A cikloheximid-pilokarpin kezelt állatoknál ezzel szemben a kontrollhoz hasonló CGRP és neo-Timm festődés volt. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a cikloheximid képes megvédeni a hiláris CGRP-pozitív sejteket a SE során; azáltal, hogy lehetővé teszi e sejtek számára, hogy megtartsák normális axonális vetületüket, az MFS megelőzhető – ez a forgatókönyv összhangban van az “irritábilis” mohasejt-hipotézissel, amely a mohasejtek túlélésére támaszkodik a hálózat hiperexcitabilitásában. Azt feltételeztük, hogy a cikloheximid megakadályozza az SE által kiváltott supragranularis MFS-t azáltal, hogy megakadályozza a hilus CGRP-pozitív sejtek (feltételezett mohasejtek) elvesztését.
A tény, hogy a cikloheximid megvédte a hilus sejteket és tovább növelte a sejtproliferációt a DG-ben SE után, megteremtette a keretet egy olyan hipotézishez, amely integrálja a jelenlegi megfigyeléseket. A kutatók kimutatták, hogy egyes újonnan született szemcsesejtek a hiluson belül abnormális helyeken fejlődnek. Ezek az ektopikus szemcsesejtek rendszeres akciós potenciálkitöréseket mutatnak, amelyek szinkronban vannak a CA3 piramissejtek kitörési kisüléseivel és a hilus neuronok (beleértve a mohasejteket is) kitöréseivel. Az ektopikus hilusos szemcsesejtek kialakulásán kívül több cikk is jellemezte a hilusos bazális dendritek kialakulását a szemcsesejteken epilepsziás állatokban. Mindkét jellemző minden bizonnyal lehetővé teszi az aberrált szinapszisok kialakulását a hilusban, akár ektopikus vagy irritábilis sejtek, akár aberrált bazális dendritek révén, ami a hiperexcitabilitás változásait magyarázhatja – függetlenül a szupragranuláris MFS jelenlététől.