Resultados
Inicialmente demostramos que la administración de cicloheximida, muy cerca de la inducción del SE de pilocarpina, bloqueaba el SMF supragranular en ratas – pero no impedía el posterior desarrollo de convulsiones espontáneas ni afectaba a su frecuencia. Estos resultados proporcionaron, por primera vez, pruebas directas contra un papel causal del SMF supragranular en la epileptogénesis del lóbulo temporal. Una posible explicación de esta disociación es que la generación de convulsiones en los modelos de epilepsia con pilocarpina y kainato podría ser impulsada por fuentes extrahipocampales. De hecho, las contribuciones relativas del tálamo, la amígdala y el córtex piriforme en el inicio de las convulsiones espontáneas en estos modelos se han indicado en varios estudios.
Para abordar esta cuestión, utilizamos a continuación la aplicación intrahipocampal de pequeñas dosis de ácido kainico. También en este caso, la cicloheximida fue capaz de bloquear completamente el SMF supragranular en la mayoría de los animales, sin alterar la frecuencia e intensidad de los eventos EEG ictal e interictal espontáneos. Llegamos a la conclusión de que también en el modelo intrahipocampal de pequeñas dosis de kainato, en el que las convulsiones espontáneas tenían más probabilidades de iniciarse en el hipocampo inyectado, la SMF supragranular no es necesaria para la aparición de eventos ictales.
Dado que la mayor parte de nuestros análisis en los experimentos iniciales evaluaron animales 2 meses después de la lesión precipitante inicial, tratamos entonces de investigar cómo se vería afectada la SMF supragranular por las convulsiones espontáneas. Algunas publicaciones sobre este tema han mostrado que los animales con convulsiones más frecuentes tienen una SMF supragranular más intensa, sugiriendo así que esta forma de reorganización sináptica está de alguna manera asociada con una mayor propensión a las convulsiones (aunque no determine la aparición o no de las mismas). Otros investigadores han argumentado que la densidad de la SMF supragranular no está asociada con el número total de convulsiones a lo largo de la vida ni con la frecuencia de las mismas (en la epilepsia del lóbulo temporal experimental o humana), y muchos autores ya no consideran la SMF como un evento necesario o suficiente en la epilepsia del lóbulo temporal. Sin embargo, en la condición humana no tenemos control sobre el estado de fondo del tejido. Y en la mayoría de los estudios experimentales, el SE era necesario para la aparición de convulsiones – donde no hay duda de que el SMF supragranular es en gran medida el reflejo de un episodio de SE precedente. Al producir una condición experimental en la que no se derivaba ninguna SM supragranular del episodio inicial de SE, pudimos investigar la contribución relativa de las convulsiones espontáneas posteriores a esta reorganización sináptica. Concluimos que la SMF supragranular no mostraba ninguna asociación con la frecuencia de las convulsiones espontáneas, y parecía depender más críticamente del tiempo transcurrido desde la lesión inicial. De hecho, bajo esta condición, el SMF supragranular acabó desarrollándose en todos los animales, aunque a un ritmo mucho más lento; además, no parecía ser más robusto en los animales con mayor frecuencia de convulsiones espontáneas recurrentes.
La descripción de la dispersión de las células granulares en el tejido humano de pacientes con epilepsia del lóbulo temporal dio lugar a la sugerencia de que los cambios en el desarrollo podrían estar en la base de la epilepsia posterior en esos pacientes. La demostración, primero en el modelo de rata con pilocarpina y después en ratones tratados con kainato, de que los roedores adultos podían desarrollar la dispersión de las células granulares indicó que estos cambios citoarquitectónicos también podían ser consecuencia del episodio inicial precipitante de la SE. La posterior demostración de que la neurogénesis de las células granulares dentadas aumentaba tras el SE introdujo una posibilidad adicional: que la plasticidad de la red del hipocampo asociada a la epileptogénesis podría surgir de conexiones aberrantes formadas por las células granulares dentadas recién nacidas. Por lo tanto, investigamos si la cicloheximida afectaría a la aparición del SMF supragranular mediante el bloqueo de la neurogénesis de las células granulares. Para nuestra sorpresa, observamos que la proliferación celular en el GD aumentaba drásticamente en los animales epilépticos tratados con cicloheximida. La inducción de la SE en animales inyectados sólo con pilocarpina condujo a un aumento de 2 a 7 veces en la tasa mitótica de las células del gránulo dentado, en comparación con un aumento de 5 a 30 veces en los animales tratados con pilocarpina/cicloheximida. Sugerimos que este aumento de las tasas mitóticas estaba asociado a una protección por parte de la cicloheximida de una población de células precursoras vulnerables que, de otro modo, degenerarían tras la SE inducida por la pilocarpina. Además, sugerimos que el SMF y la neurogénesis de las células granulares no están necesariamente vinculados entre sí. Esta disociación es coherente con el hallazgo de que la irradiación de los animales sometidos a SE inducida por pilocarpina abolió esencialmente la neurogénesis de las células granulares de la dentadura, pero no impidió la reorganización de las fibras musgosas en la capa molecular de la dentadura.
Los registros de patch-clamp de células enteras en rodajas de hipocampo habían demostrado que la amplitud y la frecuencia de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas en las células granulares aumentaban con el tiempo después del tratamiento con kainato. Este aumento de la entrada sináptica excitatoria se correlacionó con la intensidad de la tinción de Timm en la capa molecular interna. Cuando se redujo la inhibición con bicuculina en los cortes de los animales tratados con kainato, la fotolisis flash de glutamato enjaulado aplicada en la capa de células granulares evocó estallidos epileptiformes de potenciales de acción (un efecto que no se observó en las células granulares de las ratas de control). Estos datos apoyaron la hipótesis de que el SMF supragranular inducido por el kainato resulta en la formación progresiva de conexiones excitatorias aberrantes entre las células granulares. Para evaluar los cambios en el perfil electrofisiológico que resultaría del tratamiento con cicloheximida, se realizó electrofisiología in vitro (registros extracelulares) 2 meses después del SE inducido por pilocarpina. Los potenciales evocados en cortes de ratas tratadas con pilocarpina y pilocarpina/cicloheximida mostraron una actividad polispiking de pequeña amplitud (respuestas epileptiformes) en CA1 y una población aislada de picos aparentemente normal en DG. Y lo que es más importante, el GD en los cortes de los animales tratados con pilocarpina y pilocarpina/cicloheximida no difería con respecto a las anormalidades electrofisiológicas, incluso bajo alto K+ o alto K+/bicuculina. El análisis de la tinción de neo-Timm, como se esperaba, reveló una fuerte MFS supragranular en las ratas inyectadas con pilocarpina y una tinción significativamente menor en las ratas con pilocarpina/cicloheximida. Por lo tanto, la aparición de respuestas de estímulo anormales, y las actividades epileptiformes inducidas por alto K+ o alto K+/bicuculina, no dependían del grado de SMF supragranular.
Una cuestión que se plantea desde hace tiempo en relación con el desarrollo de SMF en modelos animales de SE es si las fibras musgosas brotadas añadirían nuevas sinapsis a las dendritas en la capa molecular – o si estas fibras brotadas simplemente sustituían a las sinapsis vacías (debido a la degeneración de las células hiliares). De hecho, la mayoría de los estudios sobre el tema sugieren que la pérdida de células musgosas hiliares, normalmente un objetivo hiliar importante de las fibras musgosas de las células granulares, es un factor importante para iniciar el SMF supragranular. El SE inducido por la pilocarpina en presencia de cicloheximida dio lugar a un número reducido de células hiliares lesionadas en comparación con las ratas no pretratadas con cicloheximida. Las presuntas células musgosas, identificadas mediante inmunohistoquímica del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), no se redujeron significativamente en ninguno de los grupos 60 días después de la SE (dada la aparente incoherencia de este hallazgo con una preponderancia de pruebas que indican una pérdida de células musgosas SE, suponemos que el CGRP podría constituir un marcador de una subpoblación de células musgosas). Mientras que los controles tenían una fuerte banda de fibras CGRP-positivas (putativos axones de células musgosas) y ninguna fibra teñida de neo-Timm en la capa molecular interna, las ratas tratadas con pilocarpina no tenían fibras CGRP y una fuerte tinción de neo-Timm. Los animales tratados con cicloheximida-pilocarpina, por el contrario, presentaban una tinción de CGRP y neo-Timm similar a la de los controles. Llegamos a la conclusión de que la cicloheximida podría proteger las células hiliares CGRP-positivas durante el SE; al permitir que esas células retuvieran su proyección axonal normal, se evitó el SMF – un escenario consistente con la hipótesis de las células musgosas «irritables» que se basa en la supervivencia de las células musgosas para la hiperexcitabilidad de la red. Sugerimos que la cicloheximida previene el SMF supragranular inducido por el SE al impedir la pérdida de células hiliares positivas al CGRP (putativas células musgosas).
El hecho de que la cicloheximida protegiera las células hiliares y aumentara aún más la proliferación celular en el GD después del SE creó el escenario para una hipótesis que integra las observaciones actuales. Los investigadores han demostrado que algunas células granulares recién nacidas se desarrollan en ubicaciones anormales dentro del hilio. Estas células granulares ectópicas muestran ráfagas regulares de potenciales de acción que están sincronizadas con las descargas de las células piramidales CA3 y las ráfagas de las neuronas hiliares (incluidas las células musgosas). Además de la formación de células granulares hiliares ectópicas, varios artículos han caracterizado la formación de dendritas basales hiliares en células granulares en animales epilépticos. Ambas características permiten, sin duda, la existencia de sinapsis aberrantes en el hilio, ya sea por células ectópicas o irritables o en dendritas basales aberrantes, lo que puede explicar los cambios en la hiperexcitabilidad, independientemente de la presencia del SMF supragranular.