Cycloheximid

Ergebnisse

Wir konnten zunächst nachweisen, dass die Verabreichung von Cycloheximid in unmittelbarer Nähe der Induktion von Pilocarpin-SE die supragranuläre MFS bei Ratten blockierte – aber weder die anschließende Entwicklung spontaner Anfälle verhinderte noch deren Häufigkeit beeinflusste. Diese Ergebnisse lieferten zum ersten Mal direkte Beweise gegen eine kausale Rolle der supragranulären MFS bei der Epileptogenese im Schläfenlappen. Eine mögliche Erklärung für diese Dissoziation ist, dass die Anfallserzeugung in den Pilocarpin- und Kainat-Modellen der Epilepsie durch extrahippocampale Quellen angetrieben werden könnte. Die relativen Beiträge von Thalamus, Amygdala und piriformer Rinde bei der Auslösung spontaner Anfälle in diesen Modellen wurden in einer Reihe von Studien aufgezeigt.

Um diese Frage zu klären, verwendeten wir als nächstes die intrahippocampale Verabreichung von Kaininsäure in geringer Dosis. Auch hier konnte Cycloheximid bei den meisten Tieren die supragranuläre MFS vollständig blockieren, ohne die Häufigkeit und Intensität spontaner ictaler und interictaler EEG-Ereignisse zu verändern. Wir kamen zu dem Schluss, dass auch im intrahippocampalen Kainat-Modell mit geringer Dosis, bei dem spontane Anfälle eher im injizierten Hippocampus ausgelöst werden, die supragranuläre MFS für das Auftreten von ictalen Ereignissen nicht notwendig ist.

Da die meisten unserer Analysen in den ersten Experimenten Tiere 2 Monate nach der auslösenden Verletzung untersuchten, wollten wir anschließend untersuchen, wie die supragranuläre MFS durch die spontanen Anfälle beeinflusst wird. Einige Veröffentlichungen zu diesem Thema haben gezeigt, dass Tiere mit häufigeren Anfällen eine intensivere supragranuläre MFS aufweisen, was darauf hindeutet, dass diese Form der synaptischen Reorganisation in irgendeiner Weise mit einer größeren Anfallsneigung verbunden ist (auch wenn sie nicht dafür verantwortlich ist, ob Anfälle auftreten oder nicht). Andere Forscher haben argumentiert, dass die Dichte der supragranulären MFS nicht mit der Gesamtzahl der lebenslangen Anfälle oder der Anfallshäufigkeit (bei experimenteller oder menschlicher Schläfenlappenepilepsie) zusammenhängt, und viele Autoren betrachten MFS nicht mehr als ein notwendiges oder hinreichendes Ereignis bei Schläfenlappenepilepsie. Beim Menschen haben wir jedoch keine Kontrolle über den Hintergrundstatus des Gewebes. Und in den meisten experimentellen Studien war SE für das Auftreten von Anfällen erforderlich – wobei außer Frage steht, dass supragranuläres MFS weitgehend das Spiegelbild einer vorangegangenen SE-Episode ist. Indem wir eine experimentelle Bedingung herstellten, in der keine supragranuläre MFS aus der anfänglichen SE-Episode abgeleitet wurde, konnten wir den relativen Beitrag nachfolgender spontaner Anfälle zu dieser synaptischen Reorganisation untersuchen. Wir kamen zu dem Schluss, dass die supragranuläre MFS nicht mit der Häufigkeit spontaner Anfälle zusammenhängt, sondern eher von der Zeit nach der ersten Verletzung abhängt. Unter dieser Bedingung entwickelte sich die supragranuläre MFS schließlich bei allen Tieren, wenn auch viel langsamer; außerdem schien sie bei Tieren mit einer größeren Häufigkeit wiederkehrender spontaner Anfälle nicht stärker ausgeprägt zu sein.

Die Beschreibung der Streuung von Körnerzellen in menschlichem Gewebe von Patienten mit Schläfenlappenepilepsie gab Anlass zu der Vermutung, dass entwicklungsbedingte Veränderungen die Ursache für die spätere Epilepsie bei diesen Patienten sein könnten. Der Nachweis, dass erwachsene Nagetiere eine Streuung der Körnerzellen entwickeln können, zunächst im Pilocarpin-Modell für Ratten und später in Kainat-behandelten Mäusen, deutete darauf hin, dass diese zytoarchitetonischen Veränderungen auch die Folge der ersten auslösenden Episode von SE sein könnten. Der anschließende Nachweis, dass die Neurogenese von Dentat-Körnerzellen nach SE zunahm, eröffnete eine weitere Möglichkeit: Die mit der Epileptogenese verbundene Plastizität des Hippocampus-Netzwerks könnte auf abweichende Verbindungen zurückzuführen sein, die von neu geborenen Dentat-Körnerzellen gebildet werden. Wir untersuchten daher, ob Cycloheximid das Auftreten von supragranulärem MFS durch die Blockierung der Körnerzellen-Neurogenese beeinflussen würde. Zu unserer großen Überraschung stellten wir fest, dass die Zellproliferation in der DG bei epileptischen Tieren, die mit Cycloheximid behandelt wurden, dramatisch zunimmt. Die Induktion von SE bei Tieren, denen nur Pilocarpin injiziert wurde, führte zu einer 2-7-fachen Erhöhung der Mitoserate von Dentat-Körnerzellen, verglichen mit einer 5-30-fachen Erhöhung bei mit Pilocarpin/Cycloheximid behandelten Tieren. Wir vermuteten, dass diese erhöhten Mitoseraten mit dem Schutz einer anfälligen Vorläuferzellpopulation durch Cycloheximid zusammenhängen, die ansonsten nach Pilocarpin-induzierter SE degenerieren würde. Wir vermuteten außerdem, dass MFS und Neurogenese von Körnerzellen nicht unbedingt miteinander verbunden sind. Diese Dissoziation steht im Einklang mit dem Befund, dass die Bestrahlung von Tieren, die einer Pilocarpin-induzierten SE ausgesetzt waren, die Neurogenese der Dentatum-Körnerzellen im Wesentlichen aufhob, aber die Reorganisation der Moosfasern in der Dentatum-Molekularschicht nicht verhinderte.

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen in Hippocampus-Scheiben hatten gezeigt, dass die Amplitude und Häufigkeit spontaner exzitatorischer postsynaptischer Ströme in den Körnerzellen nach einer Kainat-Behandlung mit der Zeit zunahmen. Dieser erhöhte exzitatorische synaptische Input korrelierte mit der Intensität der Timm-Färbung in der inneren Molekularschicht. Wenn die Hemmung mit Bicucullin in Scheiben von Kainat-behandelten Tieren reduziert wurde, löste die Blitzphotolyse von eingesperrtem Glutamat in der Körnerzellenschicht epileptiforme Ausbrüche von Aktionspotentialen aus (ein Effekt, der bei Körnerzellen von Kontrollratten nicht beobachtet wurde). Diese Daten stützen die Hypothese, dass Kainat-induzierte supragranuläre MFS zur fortschreitenden Bildung von abnormen Erregungsverbindungen zwischen den Körnerzellen führt. Um die Veränderungen im elektrophysiologischen Profil zu bewerten, die sich aus der Cycloheximid-Behandlung ergeben würden, wurde 2 Monate nach der Pilocarpin-induzierten SE eine In-vitro-Elektrophysiologie (extrazelluläre Ableitungen) durchgeführt. Evozierte Potenziale in Schnitten von Pilocarpin- und Pilocarpin/Cycloheximid-behandelten Ratten zeigten Polyspiking-Aktivität (epileptiforme Reaktionen) mit geringer Amplitude in CA1 und eine scheinbar normale isolierte Spike-Population in DG. Noch wichtiger ist, dass sich die DG in Schnitten von Pilocarpin- und Pilocarpin/Cycloheximid-Tieren in Bezug auf elektrophysiologische Anomalien nicht unterschieden, selbst unter hohem K+ oder hohem K+/Bicucullin. Die Analyse der Neo-Timm-Färbung zeigte erwartungsgemäß starke supragranuläre MFS bei Pilocarpin-injizierten Ratten und signifikant weniger Färbung bei Pilocarpin/Cycloheximid-Ratten. Das Auftreten abnormaler Reizantworten und hoher K+- oder hoher K+/Bicuculin-induzierter epileptiformer Aktivitäten hing also nicht vom Ausmaß der supragranulären MFS ab.

Eine seit langem bestehende Frage bezüglich der Entwicklung von MFS in Tiermodellen von SE ist, ob sprossende Moosfasern den Dendriten in der Molekularschicht neue Synapsen hinzufügen würden – oder ob diese sprossenden Fasern einfach die (aufgrund der Degeneration der Hiluszellen) frei gewordenen Synapsen ersetzen. Die meisten Studien zu diesem Thema deuten darauf hin, dass der Verlust der hilären Mooszellen, die normalerweise ein wichtiges Ziel der Körnerzellen-Moosfasern sind, ein wichtiger Faktor bei der Auslösung des supragranulären MFS ist. Pilocarpin-induzierte SE in Gegenwart von Cycloheximid führte zu einer geringeren Anzahl verletzter Hiluszellen im Vergleich zu Ratten, die nicht mit Cycloheximid vorbehandelt wurden. Vermutete moosartige Zellen, die durch immunhistochemische Untersuchungen mit Calcitonin Gene Related Peptide (CGRP) identifiziert wurden, waren 60 Tage nach SE in beiden Gruppen nicht signifikant reduziert (angesichts der scheinbaren Widersprüchlichkeit dieses Ergebnisses mit der überwiegenden Zahl von Beweisen, die auf einen Verlust moosartiger Zellen bei SE hindeuten, nehmen wir an, dass CGRP einen Marker für eine Subpopulation moosartiger Zellen darstellen könnte). Während die Kontrollen ein starkes Band von CGRP-positiven Fasern (mutmaßliche Mooszellen-Axone) und keine Neo-Timm-gefärbten Fasern in der inneren Molekularschicht aufwiesen, hatten Pilocarpin-behandelte Ratten keine CGRP-Fasern und eine starke Neo-Timm-Färbung. Mit Cycloheximid-Pilocarpin behandelte Tiere wiesen dagegen eine ähnliche CGRP- und Neo-Timm-Färbung auf wie die Kontrolltiere. Wir kamen zu dem Schluss, dass Cycloheximid die CGRP-positiven Zellen im Hilus während der SE schützen kann; indem es diesen Zellen erlaubt, ihre normale axonale Projektion beizubehalten, wird MFS verhindert – ein Szenario, das mit der Hypothese der „reizbaren“ Mooszellen übereinstimmt, die das Überleben der Mooszellen für die Hyperexzitabilität des Netzwerks voraussetzt. Wir schlugen vor, dass Cycloheximid die durch SE induzierte supragranuläre MFS verhindert, indem es den Verlust von hilären CGRP-positiven Zellen (mutmaßliche Mossy-Zellen) verhindert.

Die Tatsache, dass Cycloheximid die hilären Zellen schützte und die Zellproliferation im DG nach SE weiter erhöhte, schuf den Rahmen für eine Hypothese, die aktuelle Beobachtungen integriert. Die Forscher haben gezeigt, dass sich einige neugeborene Körnerzellen an abnormalen Stellen innerhalb des Hilus entwickeln. Diese ektopischen Körnerzellen zeigen regelmäßige Ausbrüche von Aktionspotentialen, die mit den Entladungen der CA3-Pyramidenzellen und den Ausbrüchen der Hilusneuronen (einschließlich der Mooszellen) synchronisiert sind. Zusätzlich zur Bildung von ektopischen hilären Körnerzellen wurde in mehreren Artikeln die Bildung von hilären basalen Dendriten auf Körnerzellen bei epileptischen Tieren beschrieben. Beide Merkmale lassen mit Sicherheit abweichende Synapsen im Hilus zu, entweder durch ektopische oder reizbare Zellen oder in abweichenden basalen Dendriten, die für Veränderungen der Hyperexzitabilität verantwortlich sein können – unabhängig vom Vorhandensein eines supragranulären MFS.

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