Resultater

Vi viste oprindeligt, at administration af cycloheximid i umiddelbar nærhed af induktion af pilocarpin SE blokerede supragranulær MFS hos rotter – men forhindrede ikke den efterfølgende udvikling af spontane anfald eller påvirkede deres hyppighed. Disse resultater gav for første gang direkte beviser mod en kausal rolle for supragranulær MFS i epileptogenese i tindingelappen. En mulig forklaring på denne dissociation er, at anfaldsgenerering i pilocarpin- og kainatmodellerne af epilepsi kan være drevet af ekstrahippocampale kilder. Faktisk er de relative bidrag fra thalamus, amygdala og piriform cortex i initieringen af spontane anfald i disse modeller blevet angivet i en række undersøgelser.

For at løse dette spørgsmål brugte vi næste gang den lille dosis intrahippocampal anvendelse af kaininsyre i en lille dosis. Her var cycloheximid igen i stand til helt at blokere supragranulær MFS i de fleste dyr uden at ændre frekvensen og intensiteten af spontane iktale og interiktal EEG-hændelser. Vi konkluderede, at også i den intrahippocampale kainatmodel med lille dosis kainat, hvor spontane anfald var mere tilbøjelige til at starte i den injicerede hippocampus, er supragranulær MFS ikke nødvendig for forekomsten af iktale hændelser.

I betragtning af, at de fleste af vores analyser i de første eksperimenter evaluerede dyr 2 måneder efter den indledende udløsende skade, søgte vi derefter at undersøge, hvordan supragranulær MFS ville blive påvirket af de spontane anfald. Nogle publikationer om dette emne har vist, at dyr med hyppigere anfald har en mere intens supragranulær MFS, hvilket tyder på, at denne form for synaptisk reorganisering på en eller anden måde er forbundet med en større tilbøjelighed til at anfalde (selv om det ikke bestemmer, om der opstår anfald eller ej). Andre forskere har hævdet, at tætheden af supragranulær MFS ikke er forbundet med det samlede antal livstidsanfald eller anfaldsfrekvensen (i eksperimentel eller menneskelig temporallappeepilepsi), og mange forfattere anser ikke længere MFS som en nødvendig eller tilstrækkelig begivenhed i temporallappeepilepsi. I den menneskelige tilstand har vi imidlertid ingen kontrol over vævets baggrundsstatus. Og i de fleste eksperimentelle undersøgelser var SE påkrævet for fremkomsten af anfald – hvor der ikke er tvivl om, at supragranulær MFS i vid udstrækning er en afspejling af en forudgående SE-episode. Ved at fremstille en eksperimentel betingelse, hvor der ikke blev afledt supragranulær MFS fra den indledende SE-episode, kunne vi undersøge det relative bidrag fra efterfølgende spontane anfald til denne synaptiske reorganisering. Vi konkluderede, at supragranulær MFS ikke viste nogen sammenhæng med hyppigheden af spontane anfald og syntes at afhænge mere kritisk af tiden efter den oprindelige skade. Under denne betingelse udviklede supragranulær MFS sig nemlig til sidst i alle dyr, om end i et meget langsommere tempo; endvidere syntes den ikke at være mere robust hos dyr med større hyppighed af tilbagevendende spontane anfald.

Beskrivelsen af granulecellespredning i humant væv fra patienter med epilepsi i tindingelappen gav anledning til den tanke, at udviklingsmæssige ændringer kunne ligge til grund for den efterfølgende epilepsi hos disse patienter. Påvisningen, først i pilocarpinrotmodellen og senere i kainatbehandlede mus, af, at voksne gnavere kunne udvikle granulecelledispersion, indikerede, at disse cytoarkitoniske ændringer også kunne være en følge af den første udløsende episode af SE. Den efterfølgende påvisning af, at neurogenese af dentate granuleceller var øget efter SE, introducerede en yderligere mulighed – at hippocampal netværksplasticitet i forbindelse med epileptogenese kunne opstå af afvigende forbindelser dannet af nyfødte dentate granuleceller. Vi undersøgte derfor, om cycloheximid ville påvirke indtræden af supragranulær MFS ved hjælp af blokering af granulecelle-neurogenese. Til vores store overraskelse observerede vi, at celleproliferationen i DG øges dramatisk hos epileptiske dyr, der behandles med cycloheximid. Induktion af SE hos dyr, der blev injiceret med pilocarpin alene, førte til 2-7-dobbelte stigninger i den mitotiske hastighed af dentate granuleceller, sammenlignet med 5-30-dobbelte stigninger for pilocarpin/cycloheximid-behandlede dyr. Vi foreslog, at sådanne øgede mitosefrekvenser var forbundet med en beskyttelse ved hjælp af cycloheximid af en sårbar forstadiecellepopulation, som ellers ville degenerere efter pilocarpininduceret SE. Vi foreslog endvidere, at MFS og neurogenese af granuleceller ikke nødvendigvis er forbundet med hinanden. Denne dissociation er i overensstemmelse med det fund, at bestråling af dyr udsat for pilocarpin-induceret SE i det væsentlige afskaffede dentate granulecelle neurogenese, men undlod at forhindre mossy fiber reorganisering i dentate molekylære lag.

Hele celle patch-clamp optagelser i hippocampale skiver havde vist, at amplituden og frekvensen af spontane excitatoriske postsynaptiske strømme i granuleceller steg med tiden efter kainatbehandling. Dette øgede excitatoriske synaptiske input var korreleret med intensiteten af Timm-farven i det indre molekylære lag. Når hæmningen blev reduceret med bicucullin i skiver fra kainatbehandlede dyr, fremkaldte flashfotolyse af caged glutamat anvendt i granulecellelaget epileptiforme udbrud af aktionspotentialer (en effekt, der ikke blev set i granuleceller fra kontrolrotter). Disse data understøttede hypotesen om, at kainatinduceret supragranulær MFS resulterer i den progressive dannelse af afvigende excitatoriske forbindelser mellem granuleceller. For at vurdere de ændringer i den elektrofysiologiske profil, der ville være resultatet af cycloheximidbehandling, blev der udført in vitro-elektrofysiologi (ekstracellulære optagelser) 2 måneder efter pilocarpin-induceret SE. Evokationspotentialer i skiver fra pilocarpin- og pilocarpin/cycloheximid-behandlede rotter viste polyspiking-aktivitet med lille amplitude (epileptiform respons) i CA1 og en tilsyneladende normal isoleret populationsspike i DG. Endnu vigtigere er det, at DG i skiver fra pilocarpin- og pilocarpin/cycloheximid-dyr ikke adskilte sig med hensyn til elektrofysiologiske abnormiteter, selv under høj K+ eller høj K+/bicucullin. Analyse af neo-Timm-farvningen afslørede som forventet en stærk supragranulær MFS hos pilocarpin-injicerede rotter og betydeligt mindre farvning hos pilocarpin/cycloheximid-rotter. Således var forekomsten af unormale stimulusresponser og høj K+- eller høj K+/bicucullin-inducerede epileptiforme aktiviteter ikke afhængig af graden af supragranulær MFS.

Et af de langvarige spørgsmål vedrørende udviklingen af MFS i dyremodeller af SE er, om spirende mosfibre ville tilføje nye synapser til dendriterne i det molekylære lag – eller om disse spirende fibre blot erstattede ledige synapser (på grund af hylærcelledegeneration). De fleste undersøgelser om emnet tyder faktisk på, at tabet af hylære mossyceller, som normalt er et vigtigt hylære-mål for granulecelle-mossyfibre, er en vigtig faktor for indledningen af supragranulær MFS. Pilocarpin-induceret SE i tilstedeværelse af cycloheximid resulterede i et reduceret antal skadede hilære celler sammenlignet med rotter, der ikke blev forbehandlet med cycloheximid. Formodede mossy celler, identificeret ved calcitonin genrelateret peptid (CGRP) immunohistokemi, var ikke signifikant reduceret i nogen af grupperne 60 dage efter SE (i betragtning af den tilsyneladende inkonsekvens af dette fund med en overvægt af beviser, der indikerer et tab af mossy celler SE, antager vi, at CGRP kan udgøre en markør for en sub-population af mossy celler.). Mens kontroller havde et stærkt bånd af CGRP-positive fibre (formodede mossy celle axoner) og ingen neo-Timm farvede fibre i det indre molekylære lag, havde pilocarpin-behandlede rotter ingen CGRP-fibre og stærk neo-Timm farvning. Cykloheximid-pilocarpin-behandlede dyr havde derimod CGRP- og neo-Timm-farvning svarende til kontroldyrene. Vi konkluderede, at cycloheximid kunne beskytte hylære CGRP-positive celler under SE; ved at give disse celler mulighed for at bevare deres normale axonale projektion blev MFS forhindret – et scenarie, der er i overensstemmelse med den “irritable” mossy-cellehypotese, der er afhængig af mossy-cellernes overlevelse for netværkets hyperexcitabilitet. Vi foreslog, at cycloheximid forhindrer SE-induceret supragranulær MFS ved at forhindre tabet af hylære CGRP-positive celler (formodede mossy-celler).

Den kendsgerning, at cycloheximid beskyttede hylære celler og yderligere øgede celleproliferation i DG efter SE, skabte rammerne for en hypotese, der integrerer aktuelle observationer. Forskere har vist, at nogle nyfødte granuleceller udvikler sig på unormale steder i hilus. Disse ektopiske granuleceller udviser regelmæssige udbrud af aktionspotentialer, der er synkroniseret med CA3-pyramidalcelleudladninger og udbrud fra hilus-neuroner (herunder mossy-celler). Ud over dannelsen af ektopiske hylære granuleceller har flere artikler karakteriseret dannelsen af hylære basale dendritter på granuleceller hos epileptiske dyr. Begge træk giver helt sikkert mulighed for afvigende synapser i hilus, enten ved ektopiske eller irritable celler eller i afvigende basale dendritter, hvilket kan forklare ændringer i hyperexcitabilitet – uanset tilstedeværelsen af supragranulær MFS.