Bilag A: Yderligere indsigt i crista og hårcellers rumlige organisering

Den globale form af cristae varierer med arten. Den blev beskrevet for anamnioter (fisk og padder) og for amnioter (krybdyr, fugle, pattedyr).

I fisk er cristaen i alle SCC’er saddelformet og smal i midten. For lodrette SCC’er er crista bredere ved de to komponenter af grænsen (kaldet planum semilunatum). Hos frøer har cristaen i de vertikale SCC’er en dumbbell-form med en fremtrædende buet overflade i midten, men cristaen i den laterale kanal har en enkelt kølleformet receptorzone placeret i den ene ende. Fra dette forstørrede receptorområde rager en enkelt kopulær masse ud langs væggen for at nå toppen, og en noget tyndere del udspringer fra resten af crista-receptorområdet og fuldender hovedparten af kopulaen (Hillman 1974).

I amnioter, f.eks. hos rokker, øgler, skildpadder, duer, de fleste gnavere (mus, rotter, gerbil, men ikke chinchilla), katte, aber og mennesker, kan cristae i de lodrette kanaler (bageste og forreste) have form som en dumbbell. De har to hemi-cristae, hver med en central zone, der er adskilt af et septum cruciatum (fig. 2; Lindeman 1969). I dette tilfælde strækker cupula sig fra receptorbasen som to buede masser, der er forbundet på tværs af midten af en tyndere region. I modsætning hertil har den horisontale kanal i almindelighed kun ét centralt område. Morfologiske variationer mellem horisontale og vertikale SCC’er er ikke overraskende; horisontale kanaler optrådte senere i evolutionen og anvender forskellige genudtryk til deres udvikling. For den laterale SCC sker depolarisering af HC’erne, når kraften udøves mod utriculus, men for de vertikale kanaler sker derimod depolarisering, når kraften udøves mod kanalen (fig. 2).

Morfologiske undersøgelser udført af Landolt et al. (1972) på duer, fremhævede, at overfladegeometrien af cristae i de forreste og bageste membranøse ampullae er væsentligt forskellig fra den i den laterale membranøse ampullae. Set oppefra minder indholdet af ampullerne i forbindelse med de lodrette kanaler om et kors. De kortere arme af dette kors består af to fremspring, eminentiae cruciatae, og umboen mellem dem, torus septi. Der er således morfologisk set “to cristae” i hver ampulla. Hver af disse “to cristae” er saddelformet, men crista ampullaris i den laterale membranøse ampulla er en v-formet kam, der krydser den korte akse af lumenet i den membranøse ampulla, ligesom en katenoide. I de tre ampuller udviser crista ampullaris imidlertid en bilateral symmetri omkring et medialplan til torus og en anden bilateral symmetri omkring det mediale tværplan, der er parallelt med cupula (fig. 2, panel c).

Crista ampullaris når op på en tredjedel af ampullens højde og indeholder neuroepitelet, blodkarrene og nervefibrene. Neuroepithelet består hovedsagelig af hårceller og af støtteceller, der i høj grad er ansvarlige for de biomekaniske egenskaber af crista og for de reologiske egenskaber af gelen i cupula; de celler, der støder op til det sensoriske epithel, bidrager også til gelens struktur (Lindeman 1969; Dohlman 1971).

Hårcellerne på crista

I amnioter findes der mindst to forskellige typer hårceller (HC’er): type I-cellerne er omsluttet af calyces dendritter fra afferente neuroner, på indersiden af crista-epithelet, men type II-cellerne er kontaktet af bouton-termineringer (Wersäll 1954, 1956). (Bemærk, at størstedelen af de afferente neuroner hos pattedyr er dimorfe og kontakter både type I og type II HC’er). Den vigtigste fysiologiske gradient er dog givet af positionen i epitelet, for eksempel på crista er de fleste fasiske celler i centrum og de mere toniske i periferien (Goldberg og Brichta 1998; Eatock og Songer 2011). Hos fugle er type I HC’er begrænset til centrum af crista, men hos pattedyr findes type I HC’er overalt, og hos primater er der en dominans af type I-celler på hele crista (jf. Lysakowski og Goldberg 2008 om egernabe). Pattedyrs crista har imidlertid en koncentrisk organisation med tre typer af afferente neuroner og HC-fysiologi og -morfologi: et center, en mellemzone og en periferi.

Hårcelletætheden er ikke ensartet over crista-overfladen; den er betydeligt højere i periferien end i midten (Hillman 1974; Lindeman 1969). Tæthedsforskellen mellem centrum og periferi er mere markant for type I-celler, mens type II-celler var mere ensartet fordelt mellem toppen og periferien af cristae (Goldberg og Brichta 1998). Hårbundterne er kortere i den centrale region end i de perifere regioner af cristae (jf. også Njeugna et al. 1996).

Hårbundterne (HB’erne) i HC’erne har en række forskellige morfologier og fysiologier for alle epithelier i vestibulære endeorganer, kanalens crista eller otolithens macula (Brichta et al. 2002).

De stereocilia af et HB er indsat i spidsen af HC i en regelmæssig opstilling, og de er indbyrdes forbundet på mindst tre måder: basale forbindelser, lateral kontakt og spidsforbindelser, (Howard et al. 1988). Det blev bevist (i det mindste for vibrerende bevægelser), at bundtudbøjningen er synkron og kohærent (Kozlov et al. 2006).

Flere undersøgelser har rapporteret om kinociliens indsættelse i cupula-skallen, og filamenter, der danner slør og rør, der forbinder stereocilia til subcupula-rummet (Suzuki et al. 1984; Rüsch og Thurm 1989).

Cupula struktur

Kupulaen blev først beskrevet med præcision af Steinhausen (1933) som en geléagtig substans, der strækker sig til ampullaens tag og ud til dens sidevægge.

Differente teorier blev foreslået for cupulaen. Zalin (1967) foreslog, at cupulaen er ophængt fra ampullaens tag. Dohlman (1971) foreslog, at cupula bevæger sig som et stempel, og foreslog, at endolymphvæsken cirkulerer ved ampullens tag og ikke langs crista, men senere (1977, 1980) foreslog han et andet synspunkt, nemlig at endolymphen cirkulerer i det subcupulære rum. Rüsch og Thurm (1989) gav argumenter til fordel for en anden sammensætning af væsken i cupula antrum (Muller 1999).

I paddefisk har Yamauchi et al. (2001) vist, at cupula kan løsrive sig fra taget, men forbliver fastgjort på grænsen af crista.

Dohlman (1977, 1980) foreslog desuden, at stive strukturer, som filamenter eller rør, forbinder stereocilia til cupula. En sådan filamentagtig struktur blev også observeret af Suzuki et al. (1984), og Rüsch og Thurm (1989), Takumida (2001). Denne struktur kan dog afhænge af artsforskelle. For eksempel rapporterede Silver et al. (1998) om fraværet af sådanne strukturer hos paddefisk. Optimaliteten af et tyndt subcupulært rum til at øge følsomheden blev bevist af Muller (1999).

Fra Hillman og McLaren (1979), der studerede frøer, og Silver et al. (1998), der studerede østerspaddefisk (opsanus tau), kan vi udlede, at cupulakomplekset består af fire dele (Fig. 3): laterale vinger på begge sider, fælles centrale søjler i midten (som danner den cupulære skal) og et cupula antrum nær crista, fyldt med isotropisk gel, forstærket med kollagen, der løber lodret (jf. Hunter-Duvar og Hinojosa 1984 for pattedyr). Den cupulære skal er lavet af bindevævsfibre, tæt pakket og tværbundet. I overensstemmelse hermed skelner Takumida (2001) mellem cupula i snæver forstand (for cupular shell) og subcupular meshwork (for cupular antrum).

Det cupulære antrum indeholder et vandigt medie, hvori hårcellebundterne (dannet af flere stereocilia og et enkelt kinocilium) rager ud, som udspringer fra den apikale overflade af de sensoriske hårceller (Hillman og McLaren 1979). Denne gel kan være fri for materiale, som hos paddefisk (Silver et al. 1998), men den kan også være fuld af forbindelsesstrukturer, som hos marsvin (Takumida 2001). Hos marsvin beskrev Wersäll (1956) fine lodrette kanaler, hvor HC-bunkerne er placeret. Dette ensemble af forbindende tynde fibre og ciliae er af Takumida (2001) blevet kaldt det subcupulære netværk. Dette er en masse af ekstracellulært, højt specialiseret materiale (Landolt et al. 1972; Silver et al. 1998).

Takumida foreslog et funktionelt forhold mellem de sensoriske hårceller og cupula (Takumida 2001). Ifølge hans observation tyder den stærkt tværbundne isotrope tekstur af cupula-skallen på, at dette lag kan fungere som en stiv plade og fordeler træghedskræfterne ligeligt ved den store masse af hele cupula til alle sansehårbundter. Skubspændinger som følge af den relative acceleration af cupulaen resulterer i en forskydningsbelastning af selve cupulaen. Den energi, der kommer fra cupulaens bevægelse, overføres direkte eller indirekte til sansehårene gennem det subcupulære netværk. Denne observation af Takumida er det vigtigste grundlag for vores hypotese om invarians. Faktisk er det cupulære systems funktion at omdanne den tredimensionelle cupula-deformation til en endimensionel hårcellebøjning, og vi fortolker Takumidas hypotese om lige fordeling af kræfter som en hypotese om dimensionel reduktion ved hjælp af en symmetrigruppe med én parameter.

Cupula-modeller

Der er nu eksperimentelle beviser for, at cupulaen forskydes som en membran, når den udsættes for en trykgradient (Hillman og McLaren 1979; Yamauchi et al. 2001).

Standardteorien er, at cupulaen er analog med en tromlemembran (Landolt et al. 1972). Også Van Buskirk (1976) modellerede cupula som en elastisk membran, der spænder over hele ampulla i form af et diaphragma. (For en gennemgang af cupula-modellerne, se også McLaren og Hillman 1979; Hillman og McLaren 1979.)

I henhold til de eksperimenter, der blev udført på oksefrøens cupula, foreslog McLaren og Hillman (1979) og Hillman og McLaren (1979), at bunden af cupula glider over cristaens overflade og skærer det subcupulære rum mellem cristaen og cupulaen. Bemærk, at forskydningsspændingen over hele cristaens tværgående bredde enten er excitatorisk eller inhibitorisk for alle hårceller på samme tid (Rabbitt et al. 2001), afhængigt af cupulavingernes tværgående forskydning.

Kondrachuk et al. (1987) gav en matematisk model af cupulaens tidsforløbsvariationer; de diskuterede især cupulaens viskositets-elastiske egenskaber med henblik på anvendeligheden af en membranmodel. Andre (f.eks, Astakhova 1989, 1990) har betragtet systemet som værende sammensat af et elastisk stempel (cupula) i en viskos væske (endolymph).

Vega et al. (2008) foretog en sammenligning mellem de to modeller, som viste, at cupulaadfærdsdynamikken under periodisk stimulering er ækvivalent for både stempel- og membrancupulamodellen.

Som den maksimale cupulære forskydning forekommer nær det geometriske centrum af ampullaen, forekommer den maksimale forskydningsbelastning netop på det niveau, hvor de sensoriske hårbundter rager ind i cupulaen. Dette punkt blev understreget i arbejdet af (Muller 1999). Da det er den relative forskydning mellem tilstødende cilier, der i sidste ende fører til transduktionskanals gating, synes skubbelastningen i cupula at være ideelt egnet til at aktivere hårceller. For vibrerende rotationer af hovedet indebærer den koblede dynamik i væsken i kanalerne og i cupulaen, at der findes et kritisk frekvensbånd, hvor den tværgående cupulaforskydning er proportional med og i fase med hovedets vinkelhastighed (Wilson og Melvill Jones 1979; Rabbitt et al. 2001). I dette bånd er forskydningsspændingen proportionel med volumenforskydningen på cupula-niveau. Highstein et al. (2005) og Rabbitt et al. (2001) har foretaget en simulering af dette punkt.

Der er eksperimentelle beviser for, at cupula (i) har en vis stivhed og modstår deformation fra sin hvilestilling, (ii) har viskositet og modstår ændringshastigheden af deformationen fra hvilestillingen, og (iii) har et rumligt uensartet afbøjningsfelt (Damiano og Rabbitt 1996). Rotationsstivheden \(K\) i \(SI\)-enheder er \(K = 7,1 \cdot 10^{-11}\) N m/rad (Grant og Van Buskirk 1976). Cupulaen dækker fuldstændigt ampullens tværsnit. Det er en relativt tyk struktur (en tredjedel af højden, f.eks. 0,15 mm bredde for 0,45 mm højde hos axolotl, Vega et al. 2008), men det antages, at den deformeres ensartet gennem tykkelsen, en restriktiv antagelse, som også findes i Damiano og Rabbitt (1996). Dette er i overensstemmelse med den funktionelle plan foreslået af Takumida (2001).

I vores undersøgelse har vi modelleret cupula-systemet som et inhomogent Newtonsk viskoelastisk fast stof, der består af fire homogene domæner: vingerne (eller to sidevægge), den egentlige cupula (eller to cupula-søjler), cupula antrum og crista. Gelens inkompressibilitet i antrummet er bekræftet af Selva et al. (2009); Yamauchi et al. (2001); Kassemi et al. (2005).

Det meste af den foreliggende undersøgelse vedrører antrummet, der betragtes som en hydrogel (Selva et al. 2009). Vi antager således ikke homogenitet af cupula, men vi antager homogenitet i den nederste del af cupula (antrum) i nærheden af crista. Denne hypotese er udtrykkeligt fremsat i de fleste af modelartiklerne (Selva et al. 2009; Vega et al. 2008; Damiano 1999). Da forskydningen i cupulaen er et spørgsmål om nogle få mikrometer, ofte et dusin nanometer, vil vores modelligninger svare til den lineære Hooke-lov.

Bilag B: Analyse og demonstrationer

Tensoren \(\sigma ^{ij}\) er symmetrisk (dvs, \(\sigma ^{ij}=\sigma ^{ji}\) for ethvert par \(i,j\) af indekser).

Vi opstiller den hypotese, at cupula antrum har en lineær viskoelastisk model, som er inkompressibel.

På det sensoriske epitel er grænsebetingelsen et udtryk for ligevægten af kræfter ved grænsen mellem de enkelte rum, dvs. mellem cupulafibrene og cupula antrum og mellem cupula antrum og crista:

Dynamikken beskrives af Newton-loven, der sætter lighedstegn mellem divergensen af tensor \(\sigma ^{ij}\) og summen af de påførte kræfter og den kovariante acceleration af forskydningen \(u^i\), som er inertialkraften. Dette udtrykkes ved hjælp af ligningerne (17) og (19) ved ligevægtspositioner, som opnås ved den maksimale forskydning. Bemærk, at den samlede energiudgift afhænger af dette tilfælde.

Den anden ligning er ligning (18), som udtrykker inkompressibiliteten.

Under bevægelserne bevæger den trykforskel, der udøves på cupulaens vægge, dem, hvilket genererer variationer i den interne energitæthed inde i antrummet:

Den samlede variation af den kinetiske energi er givet ved Eq. (21). Heraf vil vi udlede, at energispildet som følge af viskositeten i cupulaen er proportional med integralet af den kvadratiske norm af tensor \(\sigma \) for den største forskydning. Udtrykket ville ikke være anderledes for en viskoelastisk væske, med en hukommelseseffekt eller med en afslapningseffekt. De forskydningskræfter, der udøves på crista-epithelet, er komponenten \((\sigma .\mathbf{n})^{i}=\sum _j\sigma ^{ij}n_j\) langs normalvektoren; overførslen af information gennem HC’er indebærer, at den giver et ikke-nul bidrag i dette integral. Beregningen af udtrykket \(u_{13}\) under vores krav om invarians vil vise, at den samlede overflade af \(\varSigma \) skal være minimal, hvis vi ønsker at minimere energitabet.

Opmærksomheden henledes på, at lignende resultater bør opnås med samme bevis for en Kelvin-model af viskoelastisk fast stof eller for en Maxwell-model af viskoelastisk væske. Selv for ikke-lineære modeller kunne resultatet være berettiget, fordi systemet ved ligevægt, for maksimal forskydning, nærmer sig godt et lineært system. For en ikke-lineær model skal der imidlertid tages hensyn til andre kilder til energitab.

Fra statik til geometri

Vi overtager notationerne og hypoteserne i afsnit 2.

De fire ligevægtsligninger:

For Hodge-operatoren \(*\) har vi

og

Derpå

Det giver

Dette giver:

Så koefficienten af \(\mathrm{d}x^1\mathrm{d}x^2\) i \(*\mathrm{d}*\mathrm{d}\beta \) må være nul, hvilket giver den første ligning:

Og koefficienten i \(\mathrm{d}x_2\mathrm{d}x_3\) giver den tredje ligning:

Vi får endnu en ligning ved at udtrykke, at \(\mathrm{d}*\beta =0\). Ud fra følgende formel:

den fjerde ligevægtsligning er:

Bevis for sætning 1

Bevis for sætning 3

Vi skriver Eq. (73) i orden et i \(x_3\). Koefficienterne \(g^{{ij}\) fås ved inversion af matricen \(g_{ij}\):

Så får vi ved første orden i \(x_3\)

Nu skriver vi \(b\) for den tredje koefficient i \(x_3\) af \(\(\beta ^{1}\), Eq. (73) i orden et, kan skrives

som giver resultatet for \(\beta \), når vi bruger \(b_1^{1}+b_2^{2}=0\). Men \(u_1=g^{11}\beta ^{1}+g^{12}\beta ^{2}\) således i orden \(3\) i \(x_3\) har vi:

som giver det andet resultat. \(\(\kvadrat \)

Bevis for sætning 4

Sætningen følger af definitionerne ved gruppering af termerne.

For eksempel:

det samme for \(u_{22}\) og \(u_{33}\). Nu for de blandede symboler:

Og for det sidste:

det vil sige

Herfra følger det annoncerede resultat. \(\(\square \)

Bevis for den første konsekvens af sætning 4

Vi har som hypotese, at sporet af \(u_{ij}\) er nul, dvs. \(u_1^{1}+u_2^{2}=0\), hvilket giver i orden nul i \(x_3\):

men vi havde allerede

Bevis for den anden konsekvens af sætning 4

Dette følger af hypotesen om, at \(u^{13}\) er invariant ved \(\(\partial _1\). \(\(\kvadrat \)

Bevis for sætning 5

hvor \(c\) betegner koefficienten for \(x_3^{3}\) i \(\beta ^{2}\). Resultatet følger. \(\(\square \)

Bevis for sætning 6

derfor

Vi ved fra sætning 3, at

Derimod har vi fra den anden følgesætning i sætning 4, at \(\partial _1b_{11}=0\), så:

Appendiks C: Geometri. Invariante minimale overflader

Vores mål var at bevise de to rent geometriske udsagn, der bruges til at karakterisere cristafladens form ud fra dens invarians og dens minimalitet.

Bevis for sætning A

Ved integration af \(\sqrt{g_{22}}\) kan vi antage, at

Vi verificerer direkte, at

derfor

Dertil kommer, at invariansen af \(g_{ij}\) indebærer

hvilket giver ved definition af symbolerne \(b_{ij}\):

Aksen og vinkelhastigheden er givet af følgende vektor:

I alle de andre tilfælde skal vi verificere, at vinkelhastighedsvektoren \(v\) er uafhængig af \(x_2\).

Hvis vi beregner den afledte af \(v\) ved \(\partiel _1\), finder vi

Men vi har \(\partiel _1A_2=0\), og

På den anden side, ved at beregne kommutatoren \(=A_1A_2-A_2A_1\), finder vi:

Dette indebærer de tre følgende betingelser:

Sammen fortæller de netop, at \(\(\partial _2v=0\).

for glatte funktioner \(R,A\) af \(x_2\). Følgelig er der glatte funktioner \(F,G,B\) af \(x_2\), således at

Dette giver

hvor et primtal betegner den afledte med hensyn til \(x_2\). Så

Vi bemærker den yderligere begrænsning:

som fortæller, at \(AB(x_2)\) måler det område, der er omsluttet af buen af den plane kurve \((X(x_2),Z(x_2))\).

Nu

I det tilfælde, hvor \(A=0\), men \(B\ne 0\), er \(\varSigma \) en omdrejningsflade, og der findes en funktion \(R(y)\), således at vi kan skrive:

\(\square \)

Bevis for udsagn B

En hvilken som helst omdrejningsflade er givet ved følgende ligninger:

Enkle beregninger verificerer, at

Enhedsnormalvektoren er

Sådan har vi

Hvilket giver

For at have en minimal overflade skal vi have \(b_{{\theta }^{\theta }^{\theta }+b_{y}^{y}=0\), dvs. differentialligningen

Alle løsninger er givet ved formlen

hvor \(a,y_0\) er en hvilken som helst positiv realkonstant. \(\(\kvadrat \)

Beviset for det generelle tilfælde (ii) er mere udførligt. Vi begynder med at bruge Eq. (107) til direkte at beregne \(g_1(x_2)\).

Den første ligning \(\(\partiel _2(b_{11}/g_1)=b_{22}\partiel _2g_1\), kan skrives

Ved tilføjelse af minimalitetshypotesen \(b_1^{1}+b_2^{2}=0\), giver det

Der findes altså en konstant \(C_1\) sådan, at \(b_1^{1}=C_1/g_{11}\), hvilket også kan udtrykkes ved

Nu er den tredje ligning \(b_{11}b_{22}-b_{12}^{2}=-g_1\partial _2^{2}g_1\) ækvivalent med den anden ordens differentialligning

Denne ligning er nem at integrere: alle positive løsninger er givet ved formlen

hvor \(a,b,c\) er vilkårlige konstanter, der blot er forbundet af begrænsningen \(C_1^{2}+C_2^{2}=a^{2}b^{2}\).

Herfra beregner vi Gauss-krumningen

Opmærksomheden henledes på, at \(g_2=1\).

Vi har

Opmærksomheden henledes på, at \(t’=1\). Koordinaternes ortogonalitet indebærer, at \(ZX’-XZ’=AB_0\). Vi har \(g_{11}=X^{2}+Z^{2}+A^{2}\), hvilket giver:

derfor ved differentiering

Vi har

Så

og

Vi så, at for en minimal helicoid findes der konstanter \(C_1,C_2\), således at \(b_{11}=C_1\) og \(b_{12}=C_2g_1\); således

Dertil kommer, at vi kan beregne

ved at sammenligne med

vi finder

men vi vidste allerede, at \(b^{2}a^{2}=C_2^{2}+C_1^{2}\), og vi kan antage, at \(a,b\) positiv, så dette indebærer

Dertil kommer, at formlen for \(x’_2\) giver

for \(C=B_0C_2/AC_1\); og under forudsætning af \(x_2(0)=0\) får vi således

Dette indebærer

Hvilket giver differentialsystemet for \(X(t),Z(t)\):

\(\square \)