Abstract

I den aktuella studien presenteras samtidig kvantifiering av dexpanthenol och resorcinol från marknadsförda hårvårdsprodukter. Dexpanthenol förekommer ofta som en aktiv ingrediens i produkter för personlig vård på grund av dess förskönande och stärkande egenskaper samt återställande och utjämnande egenskaper. Resorcinol däremot föreskrivs huvudsakligen för behandling av seborrheisk dermatit i hårbotten. De toxiska biverkningarna av resorcinol begränsar dess användning i dermatologiska preparat. Därför kan en noggrann kvantifieringsteknik för samtidig uppskattning av dessa två komponenter vara till hjälp för formuleringsindustrin för en noggrann analys av deras produktkvalitet. I den aktuella studien har en högpresterande vätskekromatografisk teknik utvecklats med hjälp av en C18-kolonn och en rörlig fas bestående av fosfatbuffert med pH = 2,8 med en gradienteluering. Flödeshastigheten för den rörliga fasen var 0,6 ml per minut och detektionsvåglängden var 210 nm för dexpantenol och 280 nm för resorcinol. Linjäritetsstudien utfördes med fem lösningar med koncentrationer mellan 10,34 μg-mL-1 och 82,69 μg-mL-1 () för resorcinol och 10,44 μg-mL-1 och 83,50 μg-mL-1 () för dexpanthenol. Metoden har validerats enligt ICH Q2(R1)-riktlinjerna. Den enkla provberedningen i ett enda steg, noggrannheten och precisionen (inom och mellan dagar) visar att metoden är lämplig för samtidig kvantifiering av dexpantenol och resorcinol i alla produkter för personlig vård och dermatologiska preparat som innehåller dessa två beståndsdelar.

1. Introduktion

Dexpanthenol (DP) är den alkoholiska analogen av D-pantotensyra. Kemiskt sett är det 2,4-dihydroxy-N-(3-hydroxipropyl)-3,3-dimetyl-1-butanamid som vanligen förekommer som en aktiv ingrediens i ett antal kosttillskott med vitamin B-komplex och kosmetika (krämer, salvor, lotioner etc.) för dess förskönande och stärkande egenskaper samt återställande och utjämnande egenskaper . DP absorberas genom huden och omvandlas till sin aktiva form, pantotensyra (vitamin B5), som är en prekursor för biosyntesen av koenzym A. Syraformen spelar en viktig roll i Krebscykeln . Pantotensyra betraktas också som ”antistressvitaminer” eftersom brist på den kan leda till olika typer av sjukdomar som hudirritation, dermatit, depigmentering av håret och förlamad tillväxt . I dermatologiska preparat ges den vanligen i styrkor på 2 till 5 %. På grund av dess återställande, utjämnande egenskaper och antidermatit- och depigmenteringsegenskaper används den ofta i hårvårdsprodukter och vissa vitaminberedningar.

Nästa kandidat som vi undersöker är resorcinol (RC) eller bensen-1,3-diol. Den har ett antal farmaceutiska tillämpningar som behandling av acain, seborrheisk dermatit, eksem, psoriasis och andra hudsjukdomar. Den används också i hårfärgningsmedel. Denna molekyl har dock ett antal biverkningar vid långvarig användning eller i stora doser. Forskning visar att långvarig användning av RC leder till reversibla effekter på den mänskliga sköldkörteln, vilket leder till hypotyreos. Därför är det viktigt med en exakt metod för kvantifiering av RC i formuleringar som föreskrivs för medicinsk och kosmetisk användning.

Flera kosmetiska och farmaceutiska preparat innehåller både RC och DP antingen i form av hjälpämnen eller som aktiva beståndsdelar och mycket få metoder har rapporterats för att kvantifiera dem i sådana formuleringar. De flesta av de rapporterade metoderna gäller antingen RC eller DP. De flesta av de metoder som beskrivs för kvantifiering av RC är spektrofotometriska metoder och mycket få rapporterade kromatografiska metoder. I en annan studie som genomfördes i vårt laboratorium utvecklade vi en teknik för kvantifiering av endast RC från en marknadsförd hårvårdsprodukt med hjälp av en isokratisk elueringsteknik med hjälp av vätskekromatografi . Denna metod är dock inte lämplig för kvantifiering av DP från en sådan formulering, vilket inspirerade oss till att utveckla denna nyare teknik. För DP har endast en enda validerad kromatografisk metod för superkritisk vätska rapporterats. Metoden beskriver kvantifieringen av den aktiva D-formen i en racemisk blandning av D- och L-formerna av panthenol från kosmetiska formuleringar med hjälp av en masspektroskopisk detektor. I denna studie presenteras en enkel, snabb, exakt och validerad teknik för samtidig kvantifiering av både DP och RC från en marknadsförd hårvårdsprodukt i närvaro av en komplex matris som består av glycerin, etanol, biotin, keratinhydrolysat, hyalkyl HBU, nikotinsyra och polyvinylpyrrolidon.

2. Material och metoder

Dexpanthenol (DP)-standard (renhet 99,65%) och resorcinol (RC)-standard (renhet 99,98%) köptes från Sigma Aldrich India Ltd. Hårvårdsformuleringen innehållande DP och RC med batchnummer HV1124, tillverkningsdatum februari 2015 och utgångsdatum juli 2017 användes som en representativ marknadsförd formulering för studien. Lösningsmedel av kromatografikvalitet köptes från Spectrochem India Limited. En C18-kolonn med en längd på 100 mm och en inre diameter på 4,0 mm köptes från Waters Limited (Waters MA, USA). Alla reagenser som användes i analysen köptes från Merck India Limited.

2.1. Utrustning och kromatografiska förhållanden

Ett Waters Alliance Separation Module (Waters, USA) kvaternärt gradientsystem och Waters 2489 dual lambda absorbansdetektor användes för kvantifiering. Analysen utfördes med hjälp av programvaran Empower 3 (Waters, USA). En Waters C18-kolonn i omvänd fas (Waters, USA) med en längd på 100 mm, en inre diameter på 4,0 mm, en partikelstorlek på 5 μm och en flödeshastighet för gradienteluering på 0,6 mL/min användes för analysen. Den rörliga fasen var en kombination av filtrerad och avgasad 5,4 mM fosfatbuffert (pH = 2,8) och acetonitril (ACN) i de proportioner som anges i tabell 1.

Analysen utfördes vid omgivande temperatur och injektionsvolymen var 20 μL. Detektionsvåglängden var 210 nm för DP och 280 nm för RC. Före den kromatografiska separationen filtrerades både standard- och provlösningarna genom ett 0,2 μm membranfilter (Pall Life science, Indien).

2.2. Beredning av standardlösningar och provlösningar

2.2.2.1. Standardlösning

Stocklösningarna för RC och DP framställdes genom att 51,68 mg RC (lösning A) och 52,19 mg DP (lösning B) löstes upp i 100 ml utspädningsmedel (90 % buffert och 10 % acetonitril) i två separata rena och torra mätkolvar med hjälp av ultraljud. Lösning A späddes till intervallet 10,34 μg-mL-1 till 82,69 μg-mL-1 och lösning B 10,44 μg-mL-1 till 83,50 μg-mL-1 med hjälp av utspädningsmedlen för analys (tabell 1). En kurva för toppyta mot koncentration framställdes (figur 1 a för RC och figur 1 b för DP) och användes för att fastställa metodens linjäritet och samma kurva användes för kvantifiering. Resultaten presenterades i tabell 2 (a och b) för RC respektive DP. Kurvanpassningen utfördes med hjälp av minsta kvadratmetoden.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 1

Kemisk struktur för resorcinol (a) och dexpantenol (b).

2.2.2. Provlösning

Förberedelsen av provlösningen var kritisk när ett antal störande ämnen fanns i matrisen som glycerin, etanol, biotin, keratinhydrolysat, hyalkyl HBU, nikotinsyra och polyvinylpyrrolidon. I vår studie har dock metoden optimerats med hjälp av en enkel provberedningsteknik i ett enda steg som var mycket lämplig för regelbundna analyser. 2 mL av formuleringen pipetterades ut noggrant och överfördes till en ren och torr mätkolv och späddes till 25 mL med rörlig fas. Denna lösning injicerades i det kromatografiska systemet efter filtrering genom 0,2 μm membranfilter.

2.2.3. Metodvalidering

Den högpresterande vätskekromatografitekniken för samtidig kvantifiering av RC och DP utfördes enligt extern kalibreringsmetod . Analysmetoden validerades på grundval av metodens noggrannhet, precision, linjäritet, intervall och robusthet. Den föreslagna metodens tillförlitlighet och noggrannhet fastställdes på grundval av återvinningsstudier. Provlösningen spikades med en standardlösning på tre olika nivåer (80 %, 110 % och 120 % av analysvärdet för var och en av RC och DP med beteckningarna RA, RB och RC respektive DA, DB och DC). Metodens precession studerades på grundval av precession av sex upprepade injektioner av standardlösningen. Linjäriteten fastställdes genom framställning av en linjär standardkurva i koncentrationsområdet 10,34 μg-mL-1 till 82,69 μg-mL-1 för RC och 10,44 μg-mL-1 till 83,50 μg-mL-1 för DP (figur 2). Samma kurvor användes för kvantifiering. Precisionen inom en dag beräknades med hjälp av sex injektioner i det högre koncentrationsområdet (41,34 μg-mL-1 för RC och 41,75 μg-mL-1 för DP) på samma dag och på olika dagar för att få precisionen mellan dagarna. Undersökningen av topprenhet användes för att fastställa metodens specificitet. En fotodiodarray-detektor (PDA) användes för ändamålet i stället för den tidigare nämnda UV-detektorn, samtidigt som de övriga kromatografiska förhållandena förblev oförändrade. Kvantifieringsgränsen (LOQ) och detektionsgränsen (LOD) bestämdes enligt den teknik som beskrivs på annat håll . Metodens robusthet bestämdes genom att experimentera med instrument av olika fabrikat. Små förändringar i de kromatografiska förhållandena, t.ex. den rörliga fasens sammansättning (±5 %) och pH-värde (±0,1 %), gjordes för att undersöka metodens robusthet.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 2

Koncentration kontra kurva för toppområde för RC (a) och DP (b) analys.

Resultatet som erhölls från varje steg genomgick en statistisk analys baserad på Sigma plot software (Version 8.02 SPSS Inc., USA) och MS Excel 2007. Data registrerades i replikat och presenterades som medelvärde ± standardavvikelse för replikatmätningarna.

3. Resultat och diskussioner

Den genomsnittliga körtiden för analysen var 28 minuter och den genomsnittliga retentionstiden för RC var minuter och för DP var minuter och för RC och DP var minuter och minuter i provlösningar. Tillräcklig upplösning observerades mellan RC och DP i standardkromatogrammet och provkromatogrammet, och de nära eluerande topparna visade tillräcklig upplösning i provkromatogrammet (figurerna 3 och 4). Detta var troligen den första rapporterade tekniken för samtidig kvantifiering av båda i en marknadsförd hårvårdsprodukt. Därför utfördes analysen med hjälp av en dubbel lambdaabsorbansdetektor med samtidig skanning vid 210 nm och 280 nm. Den kromatografiska renheten för varje komponent analyserades med hjälp av en PDA-detektor för varje komponent i fråga. Toppen för RC och DP var 0,129 respektive 0,217 och tröskelvärdet för topprenhet var 0,337 respektive 0,411. Analyttopparna var således symmetriska, rena och spektralt homogena och det finns tillräcklig upplösning mellan respektive analyttoppar i provkromatogrammet (figurerna 3 b och 4 b).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 3

Representativa kromatogram för resorcinolstandard (a) och prov (b).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 4

Representativt kromatogram för dexpantenolstandard (a) och prov (b).

3.1. Validering av den utvecklade metoden

Kvantifieringen av RC utfördes på grundval av topparean och för DP på grundval av topphöjden. Den analysmetod som diskuterats tidigare validerades enligt riktlinjerna för USP och ICH Q2(R1). De respektive parametrarna för undersökningen presenterades enligt följande:

3.1.1. Systemets lämplighet

Det kromatografiska systemets lämplighet för att utföra analysen studerades utifrån systemets lämplighet. Den representerades vanligen i termer av kolonnens effektivitet, upplösning, kapacitetsfaktor och svansningsfaktor. De teoretiska plattor som vanligtvis presenteras med bokstaven ”” definierar kolonnens effektivitet, ett mått på topparnas skärpa, och var viktiga för att upptäcka spårkomponenter. Bestämningen av toppupplösningen eller upplösningsfaktorn ”” utfördes för att säkerställa att de nära eluerande föreningarna var väl separerade från varandra, för att säkerställa systemets allmänna upplösningsförmåga och även för att säkerställa att de interna standarderna var väl upplösta för analyt-toppen. Kapacitetsfaktorn var ett mått på massfördelningen av analyten mellan den stationära och den rörliga fasen. Asymmetrin i toppen uttrycks vanligen i termer av symmetrifaktor eller svansningsfaktor. Ett värde på en enhet gavs för en perfekt symmetrisk topp och samma värde ökar med ökningen av toppens svansning. För en perfekt symmetrisk topp var värdet en enhet och samma värde ökar när tailing blir mer uttalad. Resultaten sammanfattades som teoretiska plattor (för RC och DP), kapacitetsfaktor (för RC och 1,32 för DP), toppasymmetri eller svansningsfaktor (för RC och 0,56 för DP) (tabell 3).

3.1.2. Linjäritet och intervall

För att studera metodens linjäritet användes standardlösningar i koncentrationsområdet 3,08 μg-mL-1 till 24,67 μg-mL-1 för RC och 10,44 μg-mL-1 till 83,50 μg-mL-1 för DP. Det resultat som erhölls vid analysen användes för att förbereda linjäritetskurvan. Den erhållna kurvan visade sig vara linjär med regressionsfaktor och ekvation för RC och ekvation för DP (figur 2). Detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOQ) som bestämdes med hjälp av linjäritetskurvan var 2,19 μg-mL-1 och 6,64 μg-mL-1 för RC, 0,62 μg-mL-1 och 1,89 μg-mL-1 för DP (tabell 3). Resultaten förklarade teknikens känslighet inom det aktuella analysområdet .

3.1.3. Noggrannhet

Noggrannheten var ett mått på hur nära de testresultat som erhållits med detta förfarande ligger det verkliga värdet. Det är nödvändigt att fastställa förfarandets noggrannhet inom det aktuella koncentrationsområdet. I denna studie analyserades noggrannheten på grundval av återvinningsstudien. Tre olika lösningar med koncentrationer på 80 %, 110 % och 120 % av den beräknade koncentrationen i analysen framställdes för DP respektive RC. Lösningarna framställdes genom att en känd volym standardlösningar (lösningar A och B) tillsattes till respektive provlösningar. Resultaten visade en genomsnittlig återvinning på 100,28 % med % RSD 0,82 för RC och 100,02 % respektive 0,48 för DP (tabell 4). Därför fastställdes en märkbar noggrannhet inom det område som undersöktes.

3.1.4. Precession

I vår studie fastställdes precessionen på grundval av standardavvikelsen eller den relativa standardavvikelsen för en serie mätningar som repeterbarhet och intermediär precession för den utvecklade tekniken. För repeterbarhetsstudien framställdes sex provlösningar med 100 % av testkoncentrationen separat och analyserades med hjälp av det analysförfarande som undersöktes. Samma provlösning injicerades i tre exemplar under tre på varandra följande dagar och det erhållna resultatet användes för att bestämma den intermediära precessionen. Precessionen inom en dag uppvisade ett % RSD-värde på 0,19 och det för mellandagarna varierade från 0,19 % till 0,21 % endast för RC och 0,20 och 0,11 till 0,19 för DP, vilket gör att analysförfarandet är exakt inom det undersökta området (tabell 2).

3.1.5. Specificitet

Den entydiga bedömningen av den aktuella analyten från en blandning av komponenter som föroreningar, nedbrytningsprodukter och matriskomponenter kallas specificitet . I denna studie bestämdes specificiteten för både DP och RC på grundval av kromatografisk undersökning av provlösningars topprenhet. En topp ansågs vara spektralt homogen, dvs. fri från sameution, endast om vinkeln för topprenhet var mindre än tröskelvärdet. Studien visade att topprenhetsvinkeln för RC och DP var 0,129 respektive 0,217 och att tröskelvärdet för topprenhet var 0,337 respektive 0,411 (tabell 3). Därför drogs slutsatsen att de respektive topparna var spektralt homogena, fria från alla samverkande föroreningar och specifika för samtidig analys av både RC och DP.

3.1.6. Robusthet

Robusthet definieras vanligen som förmågan hos ett analysförfarande att förbli opåverkat vid införande av små men avsiktliga variationer av de procedurparametrar som anges i förfarandedokumentationen och ger en indikation på dess stabilitet under regelbundna analyser. Den nuvarande metodens robusthet undersöktes på grundval av variationer i analytikerns, instrumentens och lösningens stabilitet och på grundval av olika lagringsförhållanden. Resultaten befanns ligga inom toleransgränserna (tabell 5).

Den aktuella metoden visade sig vara robust för samtidig kvantifiering av RC och DP (tabell 5) vid koncentrationer så låga som 6,64 μg-mL-1 för RC och 1.89 μg-mL-1 för DP (tabell 2).

4. Slutsats

Den omvända högpresterande vätskekromatografiska tekniken som utvecklades i den aktuella studien var enkel när det gäller provberedning och analys, känslig och selektiv för kvantifiering av både resorcinol och dexpantenol samtidigt, och exakt och noggrann för deras samtidiga kvantifiering från en komplex matris. Metoden har validerats med avseende på noggrannhet, precession, linjäritet och känslighet i enlighet med ICH Q2(R1)-riktlinjerna. Retentionstiden för DP och RC var 3,19 minuter och 7,2 minuter. Topparna var väl upplösta från varandra och andra nära eluerande toppar. Således är den nuvarande metoden lämplig för rutinanalys, stabilitetstestning och samtidig kvantifiering av RC och DP från olika formuleringar som finns på marknaden.

Interessentkonflikter

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter när det gäller publiceringen av denna artikel.

Acknowledgments

Författarna tackar alla medlemmar i R&D-sektionen för deras vänliga samarbete och stöd. Författarna tackar också ledningen och styrelsemedlemmarna för deras ovärderliga stöd och uppmuntran.