Promotorer styr bindningen av RNA-polymeras och transkriptionsfaktorer. Eftersom promotorregionen driver transkriptionen av en målgen bestämmer den därför tidpunkten för genuttrycket och definierar till stor del mängden rekombinant protein som kommer att produceras. Många vanliga promotorer, t.ex. CMV-, EF1A- och SV40-promotorer, är alltid aktiva och kallas därför konstitutiva promotorer. Andra är bara aktiva under särskilda omständigheter. I det här inlägget kommer vi att diskutera inducerbara promotorer, som kan växlas från ett OFF- till ett ON-tillstånd, och hur du kan använda dessa i din forskning. När du är klar med det här inlägget kan du kolla in vårt uppföljande inlägg om repressiva promotorer.

Hur regleras inducerbara promotorer?

Inducerbara promotorer kan regleras genom positiv eller negativ kontroll.

Positiv inducerbar

I OFF-tillståndet är promotorn inaktiv eftersom aktivatorproteinet inte kan binda. Efter att en inducer binder till aktivatorproteinet kan aktivatorproteinet binda till promotorn, slå på den och påbörja transkriptionen.

Negativt inducerbara

I OFF-tillståndet är promotorn inaktiv eftersom ett bundet repressorprotein aktivt hindrar transkriptionen. När en inducer binder repressorproteinet avlägsnas repressorproteinet från DNA. När repressorproteinet är frånvarande aktiveras transkriptionen.

Typer av inducerbara promotorer

Kemiska ämnen, temperatur och ljus är alla exempel på faktorer som kan leda till induktion av en promotor. Nedan hittar du en kort beskrivning av dessa tre typer av inducerbara promotorer och exempel på varje typ. Många av dessa promotorsystem finns tillgängliga hos Addgene!

Kemiskt inducerbara promotorer

Kemiskt reglerade promotorer är bland de vanligaste inducerbara promotorerna. Det positivt inducerbara tetracyklin ON-systemet (Tet-On), ett mångsidigt verktyg som utvecklats för användning i prokaryoter och eukaryoter, fungerar via direkt aktivering. I detta system är aktivatorn rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator) normalt inaktiv och kan inte binda tetracyklinresponselementen (TRE) i en promotor. Tetracyklin och dess derivat fungerar som inducerande medel för att möjliggöra aktivering av promotorn.

En av de mest använda prokaryotiska promotorerna är den negativt inducerbara pLac-promotorn. Denna promotor kräver att lac-repressorn (lacI-protein) avlägsnas för att transkriptionen ska aktiveras. I närvaro av laktos eller laktosanalogen IPTG genomgår lac-repressorn en konformationsförändring som gör att den avlägsnas från lacO-platser i promotorn och upphör med repressionen av målgenen. Ett förenklat lac-inducerbart system finns i många bakteriella expressionsvektorer.

Negativ inducerbar promotor pBad är en annan populär prokaryotisk promotor som ofta används för bakteriell proteinrening. När arabinos saknas binder det regulatoriska proteinet AraC till O- och I1-platser uppströms i pBad och blockerar transkriptionen. När arabinos läggs till får AraC AraC att binda till I1- och I2-platser, vilket gör att transkriptionen kan börja. Förutom arabinos kan cAMP i komplex med cAMP-aktivatorprotein (CAP) också stimulera AraC-bindning till I1- och I2-platser. Att komplettera celltillväxtmedia med glukos minskar cAMP och reprimerar pBad, vilket minskar promotorläckaget.

Andra exempel på kemiskt inducerade promotorer inkluderar positivt inducerbara alkohol- och steroidreglerade promotorer som vanligen används inom växtforskning.

Promotersubtyp	Promoterexempel	Aktivator	Addgene Plasmid/Kit
Alkohol-reglerad	AlcA-promotor	AlcR	pGGA008 (AlcA) och pGGC011 (AlcR) från red flame GreenGate kit
Steroid-reglerad	LexA-promotor	XVE (syntetisk)	pFZ19 (gul flamma)

Temperaturinducerbara promotorer

Temperaturkänsliga uttryckssystem är vanligen mindre läckande än kemiskt inducerade promotorer; De uppvisar nästan inget uttryck vid normala temperaturer men kan induceras genom värme- eller kylexponering. Som exempel kan nämnas de värmeschockinducerbara Hsp70- eller Hsp90-avledda promotorerna, där en valfri gen endast uttrycks efter att ha utsatts för en kortvarig värmeschock. När det gäller Hsp70 frigör värmeschocken värmeschockfaktor 1 (HSF-1), som sedan binder till värmeschockelement i promotorn och därigenom aktiverar transkriptionen. Addgene-avläggare har utvecklat värmeskocksinducerbara Cre och Cas9 för enkel genomhantering i arter som C. elegans och Drosophila.

Ljusinducerbara promotorer

Ljus är ett annat sätt att aktivera genuttryck, och tvåkomponentsystem som används inom syntetisk biologi använder ljus för att reglera transkriptionen. Red flame plasmid pDawn innehåller det blå ljuskännande proteinet YFI. När ljus saknas fosforylerar YFI FixJ, som binder till FixK2-promotorn för att inducera transkriptionen av fagrepressorn cI. Repressorn cI hämmar transkriptionen från fagerpromotorn pR, vilket förhindrar uttrycket av en reportergen. När det finns ljus är YFI inaktiv, vilket förhindrar syntesen av repressor cI och gör att transkriptionen av reportergenen kan äga rum. Addgene har också gul flamelljusreglerade tvåkomponentsystem utformade av Tabor-laboratoriet.

Vilken inducerbar promotor är rätt för mig?

Här är en lista över några viktiga variabler att ta hänsyn till när man väljer en inducerbar promotor.

Experimentellt system

Då transkriptionsmaskineriet skiljer sig åt mellan olika celltyper eller organismer är promotorer på samma sätt variabla. Bakteriella promotorer fungerar endast i prokaryota celler och vanligtvis endast i samma eller nära besläktade arter som de härstammar från. På samma sätt kräver de olika eukaryotiska celltyperna (däggdjur, jäst, växter osv.) unika promotorer och det finns mycket få korsningar. Induktionsmekanismen måste också vara kompatibel med ditt experimentella system.

Läckage

Om du uttrycker en gen som kan vara giftig är det viktigt att din inducerbara promotor inte är alltför läckande. När det gäller inducerbara prokaryotiska promotorer är pLac känt för att vara något läckande, och pBad är troligen ett bättre alternativ eftersom uttrycket kan undertryckas av glukos. Temperaturinducerbara promotorer är också kända för sin låga läckageförmåga.

Inducerbarhetsnivå

Hur mycket vill du inducera transkriptionen av din målgen? Styrkan hos inducerbara promotorer kan variera mycket. Om du är ute efter hög inducerbarhet kan Tet-On-systemet vara ett bra val, eftersom det är dokumenterat att det inducerar transkription >1 000 gånger när det aktiveras.

Lagtid

Den tid som behövs för att inducera en viss promotor varierar. Promotorer som endast kräver tillsats av en extern inducer, som Tet-system, kan aktiveras mycket snabbt. Promotorsystem som kräver transkription av en repressor/inducer kommer däremot att ha högre fördröjningstid på grund av den tid som krävs för transkription/translation.

Mycket tack till Nicole Zurcher som bidragit till skrivandet av denna artikel.

Övriga resurser på Addgene-bloggen:

• Plasmider 101: Promotorregionen
• Plasmider 101: Cre-lox
• Ljuskopplingsbara tvåkomponentsystem för E. coli
• Bläddra bland andra blogginlägg från vår serie Plasmider 101