Abstract

Studiul de față prezintă cuantificarea simultană a dexpantenolului și resorcinolului din formulele de îngrijire a părului comercializate. Dexpantenolul este adesea prezent ca ingredient activ în produsele de îngrijire personală pentru proprietățile sale de înfrumusețare și revigorare și pentru proprietățile de refacere și netezire. Pe de altă parte, resorcinolul este prescris în principal pentru tratamentul dermatitei seboreice a scalpului. Efectele secundare toxice ale resorcinolului limitează utilizarea acestuia în preparatele dermatologice. Prin urmare, o tehnică de cuantificare precisă pentru estimarea simultană a acestor două componente poate fi utilă pentru industriile de formulare în vederea unei analize precise a calității produselor lor. În studiul de față a fost dezvoltată o tehnică cromatografică lichidă de înaltă performanță folosind o coloană C18 și o fază mobilă constând în tampon de fosfat cu pH = 2,8 în urma unei eluțiuni în gradient. Debitul fazei mobile a fost de 0,6 ml pe minut, iar lungimea de undă de detecție a fost de 210 nm pentru dexpantenol și de 280 nm pentru resorcinol. Studiul de liniaritate a fost efectuat utilizând cinci soluții cu concentrații cuprinse între 10,34 μg-mL-1 și 82,69 μg-mL-1 () pentru resorcinol și 10,44 μg-mL-1 și 83,50 μg-mL-1 () pentru dexpantenol. Metoda a fost validată în conformitate cu orientările ICH Q2(R1). Ușurința pregătirii probei într-o singură etapă, studiul de acuratețe și precizie (intraday și interday) prezintă metoda ca fiind potrivită pentru cuantificarea simultană a dexpantenolului și resorcinolului din orice produs de îngrijire personală și preparate dermatologice care conțin aceste două ingrediente.

1. Introducere

Dexpantenolul (DP) este analogul alcoolic al acidului D-pantotenic. Din punct de vedere chimic, este 2,4-dihidroxi-N-(3-hidroxipropil)-3,3-dimetil-1-butanamidă prezentă în mod obișnuit ca ingredient activ într-o serie de suplimente de complexul vitaminic B și produse cosmetice (creme, unguente, loțiuni etc.) pentru proprietățile sale de înfrumusețare și revigorare și pentru proprietățile de refacere și netezire . DP este absorbit prin piele și se transformă în forma sa activă, acidul pantotenic (vitamina B5), precursor pentru biosinteza coenzimei A. Forma acidă joacă un rol important în ciclul Krebs . Acidul pantotenic este, de asemenea, considerat „vitaminele antistres”, deoarece deficitul său poate duce la diferite tipuri de boli, cum ar fi iritarea pielii, dermatită, depigmentarea părului și o creștere stingheră . În preparatele dermatologice se administrează de obicei în concentrații de 2 până la 5%. Datorită proprietăților sale reparatoare, de netezire și a proprietăților antidermatitice și de depigmentare, este adesea utilizat în produsele de îngrijire a părului și în unele formulări de vitamine.

Următorul candidat care face obiectul studiului nostru este resorcinolul (RC) sau benzen-1,3-diol. Acesta are o serie de aplicații farmaceutice, cum ar fi tratamentul acainei, dermatitei seboreice, eczemelor, psoriazisului și altor afecțiuni ale pielii. Este, de asemenea, utilizat în agenții de colorare a părului. Cu toate acestea, această moleculă are o serie de efecte secundare în cazul utilizării pe termen lung sau în doze mari. Cercetările arată că o utilizare pe termen lung a RC duce la efecte reversibile asupra glandei tiroide umane, ducând la hipotiroidism . Prin urmare, este esențială o metodă exactă de cuantificare a RC din formulele prescrise pentru uz medicinal și cosmetic.

Diverse preparate cosmetice și farmaceutice conțin atât RC, cât și DP, fie sub formă de excipienți, fie ca și componente active și foarte puține metode au fost raportate pentru cuantificarea acestora din astfel de formulări. Din nou, cele mai multe dintre tehnicile raportate prezintă metode fie pentru RC, fie pentru DP. Majoritatea metodelor descrise pentru cuantificarea RC sunt tehnici spectrofotometrice și foarte puține tehnici cromatografice raportate. Într-un alt studiu efectuat în laboratorul nostru, am dezvoltat o tehnică de cuantificare a RC numai dintr-un produs comercializat pentru îngrijirea părului, utilizând o tehnică de eluție izocratică prin cromatografie lichidă. Cu toate acestea, această metodă nu este adecvată pentru cuantificarea DP dintr-o astfel de formulare, ceea ce ne-a inspirat pentru dezvoltarea acestei tehnici mai noi. Pentru DP a fost raportată doar o singură metodă cromatografică cu fluid supercritic validată. Metoda descrie cuantificarea formei active D într-un amestec racemic de forme D și L de pantenol din preparatele cosmetice, utilizând un detector spectroscopic de masă. În studiul de față este prezentată o tehnică simplă, rapidă, precisă și validată pentru cuantificarea simultană atât a DP, cât și a RC dintr-un produs comercializat pentru îngrijirea părului, în prezența unei matrici complexe care cuprinde glicerină, etanol, biotină, hidrolizat de cheratină, hialchil HBU, acid nicotinic și polivinilpirolidonă.

2. Material și metode

Dexpantenolul (DP) standard (puritate 99,65%) și resorcinolul (RC) standard (puritate 99,98%) au fost achiziționate de la Sigma Aldrich India Ltd. (Sigma Aldrich India Ltd.). Formula de îngrijire a părului care conține DP și RC cu numărul de lot HV1124, data de fabricație februarie 2015 și data de expirare iulie 2017 a fost utilizată ca formulă comercializată reprezentativă pentru studiu. Solvenții de calitate cromatografică au fost achiziționați de la Spectrochem India Limited. O coloană C18 cu o lungime de 100 mm și un diametru intern de 4,0 mm a fost achiziționată de la Waters Limited (Waters MA, SUA). Toți reactivii utilizați în analiză au fost achiziționați de la Merck India Limited.

2.1. Echipament și condiții cromatografice

În scopul cuantificării s-a utilizat un sistem de gradient cuaternar Waters Alliance Separation Module (Waters, SUA) și un detector de absorbție Waters 2489 dual lambda. Analiza a fost efectuată cu ajutorul software-ului Empower 3 (Waters, SUA). Pentru analiză s-a utilizat o coloană Waters C18 cu fază inversă (Waters, SUA) cu o lungime de 100 mm, un diametru intern de 4,0 mm, o dimensiune a particulelor de 5 μm și un debit de eluție în gradient de 0,6 ml/min. Faza mobilă a fost o combinație de tampon fosfat 5,4 mM filtrat și degazat (pH = 2,8) și acetonitril (ACN) în proporțiile prezentate în tabelul 1.

Analiza a fost efectuată la temperatura ambiantă, iar volumul de injecție a fost de 20 μL. Lungimea de undă de detecție a fost de 210 nm pentru DP și de 280 nm pentru RC. Înainte de separarea cromatografică, atât soluția standard, cât și soluția de probă au fost filtrate printr-un filtru cu membrană de 0,2 μm (Pall Life science, India).

2.2. Prepararea soluțiilor standard și a soluțiilor de probă

2.2.1. Soluție standard

Soluțiile stoc RC și DP au fost preparate prin dizolvarea a 51,68 mg de RC (soluție A) și 52,19 mg de DP (soluție B) în 100 ml de diluanți (90% tampon și 10% acetonitril) în două baloane volumetrice separate, curate și uscate, folosind ultrasunete. Soluția A a fost diluată în intervalul de la 10,34 μg-mL-1 la 82,69 μg-mL-1 și soluția B de la 10,44 μg-mL-1 la 83,50 μg-mL-1 cu ajutorul diluanților pentru analiză (tabelul 1). A fost pregătită curba zonei de vârf în funcție de concentrație [Figura 1(a) pentru RC și Figura 1(b) pentru DP] și a fost utilizată pentru determinarea liniarității metodei și aceeași curbă a fost utilizată în scopul cuantificării. Rezultatele au fost prezentate în tabelul 2(a și b) pentru RC și, respectiv, DP. Scopul ajustării curbei a fost realizat prin metoda celor mai mici pătrate.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Figura 1

Structura chimică a rezorcinolului (a) și a dexpantenolului (b).

2.2.2. Soluția de probă

Prepararea soluției de probă a fost critică atunci când în matrice erau prezente o serie de substanțe care interferează, cum ar fi glicerina, etanolul, biotina, hidrolizatul de cheratină, hialchil HBU, acidul nicotinic și polivinilpirolidona. Cu toate acestea, în studiul nostru, metoda a fost optimizată în urma unei tehnici simple de pregătire a probelor într-o singură etapă, care a fost foarte potrivită pentru analiza obișnuită. 2 ml de formulare au fost pipetați cu precizie și transferați într-un balon volumetric curat și uscat și diluați la 25 ml cu faza mobilă. Această soluție a fost injectată în sistemul cromatografic după ce a fost filtrată printr-un filtru cu membrană de 0,2 μm.

2.2.3. Validarea metodei

Tehnica de cromatografie lichidă de înaltă performanță pentru cuantificarea simultană a RC și DP a fost realizată după metoda de calibrare externă . Metoda analitică a fost validată pe baza acurateței, preciziei, linearității, intervalului și robusteții metodei. Fiabilitatea și acuratețea metodei propuse au fost determinate pe baza studiilor de recuperare. Soluția de probă a fost îmbogățită cu soluție stoc standard la trei niveluri diferite (80%, 110% și 120% din valoarea de dozare pentru fiecare dintre RC și DP etichetate ca RA, RB și RC și DA, DB și DC, respectiv) . Precesiunea metodei a fost studiată pe baza precesiunii a șase injecții repetate ale soluției standard. Liniaritatea a fost stabilită prin prepararea curbei de liniaritate standard în intervalul de concentrație de la 10,34 μg-mL-1 la 82,69 μg-mL-1 pentru RC și de la 10,44 μg-mL-1 la 83,50 μg-mL-1 pentru DP (figura 2). Aceleași curbe au fost utilizate în scopul cuantificării. Precizia intrazilnică a fost calculată folosind șase injecții în intervalul de concentrație mai mare (41,34 μg-mL-1 pentru RC și 41,75 μg-mL-1 pentru DP) în aceeași zi și în zile diferite pentru a obține precizia interjurnală. Studiul purității vârfurilor a fost utilizat pentru a determina specificitatea metodei. În acest scop, în locul detectorului UV menționat anterior a fost utilizat un detector cu rețea de fotodiode (PDA), păstrând nealterate celelalte condiții cromatografice. Limita de cuantificare (LOQ) și limita de detecție (LOD) au fost determinate în conformitate cu tehnica descrisă în altă parte . Rezistența metodei a fost determinată prin efectuarea de experimente pe instrumente de diferite mărci. Pentru a studia robustețea metodei, s-au efectuat ușoare modificări ale condițiilor cromatografice, cum ar fi compoziția (±5%) și pH-ul (±0,1%) fazei mobile.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 2

Curba concentrației în funcție de aria vârfului pentru analiza RC (a) și DP (b).

Rezultatul obținut în fiecare etapă a fost supus analizei statistice pe baza software-ului Sigma plot (versiunea 8.02 SPSS Inc., SUA) și MS Excel 2007. Datele au fost înregistrate în replici și prezentate ca medie ± abaterea standard a măsurătorilor din replici.

3. Rezultate și discuții

Timp mediu de execuție pentru analiză a fost de 28 de minute, iar timpul mediu de retenție pentru RC a fost de minute și pentru DP a fost de minute, iar pentru RC și DP a fost de minute și minute în soluțiile de probă. S-a observat o rezoluție suficientă între RC și DP în cromatograma standard și în cromatograma probei, iar vârfurile cu eluzie apropiată au prezentat o rezoluție suficientă în cromatograma probei (figurile 3 și 4). Aceasta a fost, probabil, prima tehnică raportată pentru cuantificarea simultană a ambelor substanțe dintr-un produs comercializat pentru îngrijirea părului. pentru RC a fost găsit la 280 nm, iar pentru DP la 210 nm. Prin urmare, analiza a fost efectuată cu ajutorul unui detector de absorbție lambda dublu cu scanare simultană la 210 nm și 280 nm. Puritatea cromatografică pentru fiecare component a fost analizată cu ajutorul unui detector PDA pentru fiecare component în parte. Unghiul de puritate a vârfurilor pentru RC și DP a fost de 0,129 și, respectiv, 0,217, iar pragul de puritate a vârfurilor a fost de 0,337 și, respectiv, 0,411. Astfel, vârfurile analiților au fost simetrice, pure și omogene din punct de vedere spectral și există o rezoluție suficientă între vârfurile analiților respectivi în cromatograma probei [figurile 3(b) și 4(b)].

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 3

Cromatograme reprezentative pentru standardul de resorcinol (a) și proba (b).

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Figura 4

Cromatograma reprezentativă pentru standardul dexpanthenol (a) și proba (b).

3.1. Validarea metodei dezvoltate

Cuantificarea RC a fost efectuată pe baza ariei vârfurilor, iar pentru DP pe baza înălțimii vârfurilor. Metoda de analiză discutată anterior a fost validată în conformitate cu orientările USP și ICH Q2(R1). Parametrii respectivi pentru studiu au fost prezentați după cum urmează:

3.1.1. Adecvarea sistemului

Adecvarea sistemului cromatografic pentru efectuarea analizei a fost studiată pe baza adecvării sistemului. Aceasta a fost reprezentată, de obicei, în termeni de eficiență a coloanei, rezoluție, factor de capacitate și factor de coadă. Plăcile teoretice, prezentate de obicei cu litera „”, definesc eficiența coloanei, o măsură pentru claritatea vârfurilor, și au fost importante pentru detectarea urmelor de componente. Determinarea factorului de rezoluție a vârfului sau a factorului de rezoluție „” a fost efectuată pentru a se asigura că compușii cu eluzie apropiată erau bine separați unul de celălalt, pentru a asigura puterea generală de rezoluție a sistemului și, de asemenea, pentru a se asigura că standardele interne erau bine rezolvate pentru vârful analitului. Factorul de capacitate „” a fost o măsură pentru distribuția masică a analitului între faza staționară și faza mobilă. Asimetria vârfului a fost exprimată, de obicei, în termeni de factor de simetrie sau factor de coadă. O valoare de unitate a fost atribuită pentru un vârf perfect simetric, iar aceeași valoare crește odată cu creșterea factorului de coadă a vârfului. Pentru un vârf perfect simetric, valoarea sa a fost de unitate și aceeași valoare crește pe măsură ce coada devine mai pronunțată. Rezultatele au fost rezumate sub formă de plăci teoretice ( pentru RC și pentru DP), factor de capacitate ( pentru RC și 1,32 pentru DP), asimetrie de vârf sau factor de coadă ( pentru RC și 0,56 pentru DP) (tabelul 3) .

. Parametri Rezorcinol Dexpanthenol Adecvarea sistemului Timp de reținere (min) 7.19 3.19 Factorul de capacitate 1,08 1,32 Rezoluția de vârf 15.41 – Factorul de atenuare 0,97 0.56 Placi teoretice () Sensibilitate LOD (µg-mL-1) 2.19 0,62 LOQ (µg-mL-1) 6,64 1.89 Precizie Intraday Conținut mediu (mg/100 mL) () ± % RSD 50.41 ± 0.19 49.77 ± 0.20 Între zile Conținut mediu (mg/100 mL) (ziua 1/zi 2/zi 3) () 50.40/50.38/50.39/50.39 49.76/49.78/49.65 (% RSD) (ziua 1/zi 2/zi 3) () 0.20/0.19/0.19/0.21 0,11/0,19/0,15 Specificitate Unghiul maxim de puritate 0.129 0,217 Sheiul de puritate maximă 0,337 0.411

În ceea ce privește DP.

Tabelul 3

Date de adecvare a sistemului și de validare a metodei pentru cuantificarea simultană a DP și RC.

3.1.2. Liniaritatea și intervalul

Pentru a studia liniaritatea metodei, s-au utilizat soluții standard în intervalul de concentrație de la 3,08 μg-mL-1 la 24,67 μg-mL-1 pentru RC și de la 10,44 μg-mL-1 la 83,50 μg-mL-1 pentru DP. Rezultatul obținut în urma analizei a fost utilizat pentru a pregăti curba de liniaritate. Curba astfel obținută s-a dovedit a fi liniară, cu factor de regresie și ecuație pentru RC și și ecuație pentru DP (figura 2). Limita de detecție (LOD) și limita de cuantificare (LOQ) determinate cu ajutorul curbei de liniaritate au fost de 2,19 μg-mL-1 și 6,64 μg-mL-1 pentru RC, respectiv 0,62 μg-mL-1 și 1,89 μg-mL-1 pentru DP (tabelul 3). Rezultatele au explicat sensibilitatea tehnicii în intervalul de analiză luat în considerare .

3.1.3. Precizia

Precizia a fost o măsură a apropierii rezultatelor testelor obținute prin procedura respectivă în comparație cu valoarea reală. Este necesar să se stabilească acuratețea procedurii în intervalul de concentrație luat în considerare. În acest studiu, acuratețea a fost analizată pe baza studiului de recuperare. Trei soluții diferite la intervale de concentrație de 80%, 110% și 120% din concentrația de analiză calculată au fost pregătite pentru DP și, respectiv, RC. Soluțiile au fost pregătite prin adăugarea unui volum cunoscut de soluții standard (soluții A și B) la soluțiile de probă respective. Rezultatele au prezentat o recuperare medie de 100,28 % cu un % RSD de 0,82 pentru RC și de 100,02 % și, respectiv, 0,48 pentru DP (tabelul 4). Prin urmare, a fost stabilită o precizie apreciabilă în intervalul de studiu .

3.1.4. Precesia

În studiul nostru precesia a fost stabilită pe baza abaterii standard sau a abaterii standard relative a unei serii de măsurători precum repetabilitatea și precesia intermediară a tehnicii dezvoltate. Pentru studiul de repetabilitate, șase soluții de probă la 100% din concentrația de testare au fost preparate separat și analizate folosind procedura analitică în studiu. Aceeași soluție de probă a fost injectată în triplu exemplar timp de trei zile consecutive, iar rezultatul astfel obținut a fost utilizat pentru a determina precesia intermediară. Precesia intrazilnică a prezentat o valoare de % RSD de 0,19, iar cea interjurnală a variat de la 0,19% la 0,21% numai pentru RC și de la 0,20 și de la 0,11 la 0,19 pentru DP, ceea ce face ca procedura analitică să fie precisă în intervalul studiat (tabelul 2).

3.1.5. Specificitate

Evaluarea fără echivoc a analitului considerat dintr-un amestec de componente precum impurități, produse de degradare și componente ale matricei a fost denumită specificitate . În acest studiu, specificitatea atât a DP cât și a RC a fost determinată pe baza studiului de puritate a vârfurilor cromatografice ale soluțiilor de probă. Un vârf a fost considerat omogen din punct de vedere spectral, adică lipsit de coeluzie, numai atunci când unghiul de puritate al vârfului a fost mai mic decât pragul. Studiul a prezentat unghiul de puritate a vârfului pentru RC și DP 0,129 și, respectiv, 0,217, iar pragul de puritate a vârfului 0,337 și, respectiv, 0,411 (tabelul 3). Prin urmare, s-a concluzionat că vârfurile respective au fost omogene din punct de vedere spectral, fără impurități coelucidante și specifice pentru analiza simultană atât a RC, cât și a DP.

3.1.6. Robustețea

Robustețea a fost definită, de obicei, ca fiind capacitatea unei proceduri analitice de a rămâne neafectată la introducerea unor variații mici, dar deliberate, ale parametrilor de procedură enumerați în documentația procedurii și prezintă o indicație a stabilității sale în timpul analizelor regulate. Robustețea metodei actuale a fost studiată pe baza variațiilor de stabilitate a analistului, a instrumentelor și a soluției, precum și pe baza diferitelor condiții de depozitare. Rezultatele au fost găsite în limitele de toleranță (tabelul 5).

Metoda actuală s-a dovedit a fi robustă pentru cuantificarea simultană a RC și DP (tabelul 5) la concentrații de până la 6,64 μg-mL-1 pentru RC și 1.89 μg-mL-1 pentru DP (tabelul 2).

4. Concluzie

Tehnica cromatografică lichidă de înaltă performanță în fază inversă dezvoltată în studiul de față a fost simplă în ceea ce privește pregătirea și analiza probelor, sensibilă și selectivă pentru cuantificarea simultană a resorcinolului și dexpantenolului și precisă și exactă pentru cuantificarea lor simultană dintr-o matrice complexă. Metoda a fost validată în ceea ce privește acuratețea, precesia, liniaritatea și sensibilitatea, în conformitate cu orientările ICH Q2(R1). Timpul de retenție respectiv pentru DP și RC a fost de 3,19 minute și 7,2 minute. Vârfurile au fost bine delimitate unul față de celălalt și față de alte vârfuri cu eluzie apropiată. Astfel, metoda actuală este adecvată pentru analiza de rutină, testarea stabilității și cuantificarea simultană a RC și DP din diferite formulări disponibile pe piață.

Conflict de interese

Autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.

Recunoștințe

Autorii mulțumesc tuturor membrilor secției R&D pentru cooperarea și sprijinul lor amabil. Autorii mulțumesc, de asemenea, conducerii și membrilor consiliului pentru sprijinul și încurajarea neprețuită.

.