Abstract

Aktualne badania przedstawiają jednoczesną kwantyfikację dekspantenolu i rezorcynolu z dostępnych na rynku preparatów do pielęgnacji włosów. Dekspantenol jest często obecny jako składnik aktywny w produktach do pielęgnacji ciała ze względu na swoje właściwości upiększające i pobudzające oraz właściwości odbudowujące i wygładzające. Z drugiej strony, rezorcynol jest głównie przepisywany w leczeniu łojotokowego zapalenia skóry głowy. Toksyczne efekty uboczne rezorcynolu ograniczają jego zastosowanie w preparatach dermatologicznych. Dlatego dokładna technika kwantyfikacji do jednoczesnej oceny tych dwóch składników może być pomocna dla przemysłu preparatów do dokładnej analizy jakości ich produktów. W obecnym badaniu opracowano technikę wysokosprawnej chromatografii cieczowej z wykorzystaniem kolumny C18 i fazy ruchomej składającej się z buforu fosforanowego o pH = 2,8 po elucji gradientowej. Szybkość przepływu fazy ruchomej wynosiła 0,6 mL na minutę, a długość fali detekcji wynosiła 210 nm dla dekspantenolu i 280 nm dla rezorcynolu. Badanie liniowości przeprowadzono z zastosowaniem pięciu roztworów o stężeniach w zakresie od 10,34 μg-mL-1 do 82,69 μg-mL-1 () dla rezorcynolu i od 10,44 μg-mL-1 do 83,50 μg-mL-1 () dla dekspantenolu. Metoda została zwalidowana zgodnie z wytycznymi ICH Q2(R1). Łatwość jednoetapowego przygotowania próbki, dokładność i precyzja (w ciągu dnia i między dniami) sprawiają, że metoda ta jest odpowiednia do jednoczesnego oznaczania ilościowego dekspantenolu i rezorcynolu z dowolnego produktu higieny osobistej i preparatów dermatologicznych zawierających te dwa składniki.

1. Wprowadzenie

Dekspantenol (DP) jest alkoholowym analogiem kwasu D-pantotenowego. Pod względem chemicznym jest to 2,4-dihydroksy-N-(3-hydroksypropylo)-3,3-dimetylo-1-butanamid powszechnie obecny jako składnik aktywny w wielu suplementach witaminy B-complex i kosmetykach (kremach, maściach, balsamach itp.) ze względu na jego właściwości upiększające i pobudzające oraz właściwości odbudowujące i wygładzające. DP jest wchłaniany przez skórę i przekształca się w swoją aktywną formę, kwas pantotenowy (witamina B5), prekursor biosyntezy koenzymu A. Forma kwasowa odgrywa ważną rolę w cyklu Krebsa. Kwas pantotenowy zaliczany jest również do „witamin antystresowych”, gdyż jego niedobór może powodować różnego rodzaju schorzenia, takie jak podrażnienie skóry, zapalenie skóry, depigmentacja włosów, zahamowanie wzrostu. W preparatach dermatologicznych podawany jest zwykle w stężeniu od 2 do 5%. Ze względu na swoje właściwości odbudowujące, wygładzające, przeciwdermatologiczne i depigmentacyjne jest często stosowany w produktach do pielęgnacji włosów i niektórych preparatach witaminowych.

Kolejnym kandydatem w naszym badaniu jest rezorcynol (RC) lub benzeno-1,3-diol. Ma wiele zastosowań farmaceutycznych, takich jak leczenie kokainy, łojotokowego zapalenia skóry, egzemy, łuszczycy i innych chorób skóry. Jest on również stosowany w barwnikach do włosów. Jednak ta cząsteczka ma wiele skutków ubocznych przy długotrwałym stosowaniu lub w dużych dawkach. Badania wykazały, że długotrwałe stosowanie RC prowadzi do odwracalnego wpływu na ludzką tarczycę powodując niedoczynność tarczycy. Dlatego dokładna metoda ilościowego oznaczania RC w preparatach przepisywanych do użytku leczniczego i kosmetycznego jest niezbędna.

Wiele preparatów kosmetycznych i farmaceutycznych zawiera zarówno RC jak i DP w postaci substancji pomocniczych lub jako składniki aktywne i bardzo niewiele metod zostało zgłoszonych do ich ilościowego oznaczania z takich preparatów. Również w tym przypadku większość zgłoszonych technik przedstawia metody dla RC lub DP. Większość metod opisanych do ilościowego oznaczania RC to techniki spektrofotometryczne, a bardzo niewiele opisano technik chromatograficznych. W innym badaniu przeprowadzonym w naszym laboratorium opracowaliśmy technikę ilościowego oznaczania RC tylko z wprowadzonego na rynek produktu do pielęgnacji włosów, stosując technikę elucji izokratycznej z wykorzystaniem chromatografii cieczowej. Metoda ta nie jest jednak odpowiednia do ilościowego oznaczania DP z takich preparatów, co zainspirowało nas do opracowania tej nowszej techniki. Dla DP opisano tylko jedną zwalidowaną metodę chromatograficzną w cieczy w stanie nadkrytycznym. Metoda ta opisuje ilościowe oznaczanie aktywnej formy D w racemicznej mieszaninie form D i L pantenolu z preparatów kosmetycznych przy użyciu detektora spektroskopii masowej. W obecnej pracy przedstawiono prostą, szybką, precyzyjną i zwalidowaną technikę jednoczesnej kwantyfikacji zarówno DP jak i RC z dostępnego na rynku produktu do pielęgnacji włosów, w obecności złożonej matrycy zawierającej glicerynę, etanol, biotynę, hydrolizat keratyny, hialkil HBU, kwas nikotynowy i poliwinylopirolidon.

2. Materiał i metody

Dekspantenol (DP) standard (czystość 99,65%) i rezorcynol (RC) standard (czystość 99,98%) zakupiono w firmie Sigma Aldrich India Ltd., w której uzyskano preparaty do pielęgnacji włosów zawierające DP i RC. Preparat do pielęgnacji włosów zawierający DP i RC o numerze partii HV1124, dacie produkcji luty 2015 r. i dacie ważności lipiec 2017 r. został użyty jako reprezentatywny preparat rynkowy do badań. Rozpuszczalniki klasy chromatograficznej zakupiono w firmie Spectrochem India Limited. Kolumna C18 o długości 100 mm i średnicy wewnętrznej 4,0 mm została zakupiona w firmie Waters Limited (Waters MA, USA). Wszystkie odczynniki użyte w analizie zostały zakupione od firmy Merck India Limited.

2.1. Sprzęt i warunki chromatograficzne

Do celów kwantyfikacji użyto czwartorzędowego systemu gradientowego Waters Alliance Separation Module (Waters, USA) oraz detektora absorpcji Waters 2489 dual lambda. Analizę przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Empower 3 (Waters, USA). Do analizy użyto kolumny z fazą odwróconą Waters C18 (Waters, USA) o długości 100 mm, średnicy wewnętrznej 4,0 mm, wielkości cząstek 5 μm i gradientowym natężeniu przepływu elucji 0,6 mL/min. Fazę ruchomą stanowiło połączenie przefiltrowanego i odgazowanego 5,4 mM buforu fosforanowego (pH = 2,8) i acetonitrylu (ACN) w proporcjach przedstawionych w tabeli 1.

Analizę przeprowadzono w temperaturze otoczenia, a objętość wstrzyknięcia wynosiła 20 μL. Długość fali detekcji wynosiła 210 nm dla DP i 280 nm dla RC. Przed rozdzieleniem chromatograficznym zarówno roztwory wzorcowe, jak i roztwory próbek filtrowano przez filtr membranowy 0,2 μm (Pall Life science, Indie).

2.2. Przygotowanie roztworów wzorcowych i roztworów próbek

2.2.1. Roztwory standardowe

Roztwory podstawowe RC i DP przygotowano przez rozpuszczenie 51,68 mg RC (roztwór A) i 52,19 mg DP (roztwór B) w 100 mL rozcieńczalników (90% buforu i 10% acetonitrylu) w dwóch oddzielnych czystych i suchych kolbach wolumetrycznych za pomocą ultradźwięków. Roztwór A rozcieńczono do zakresu od 10,34 μg-mL-1 do 82,69 μg-mL-1, a roztwór B od 10,44 μg-mL-1 do 83,50 μg-mL-1 przy użyciu rozcieńczalników do analizy (Tabela 1). Sporządzono krzywą zależności powierzchni piku od stężenia (rysunek 1(a) dla RC i rysunek 1(b) dla DP), którą wykorzystano do określenia liniowości metody i taką samą zastosowano do celów kwantyfikacji. Wyniki przedstawiono w tabeli 2 (a i b) odpowiednio dla RC i DP. Dopasowanie krzywej przeprowadzono metodą najmniejszych kwadratów.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Rysunek 1

Struktura chemiczna rezorcynolu (a) i dekspantenolu (b).

2.2.2. Roztwór próbki

Przygotowanie roztworu próbki było krytyczne, gdy szereg substancji zakłócających było obecnych w matrycy, takich jak gliceryna, etanol, biotyna, hydrolizat keratyny, hyalkyl HBU, kwas nikotynowy i poliwinylopirolidon. Jednak w naszych badaniach metoda została zoptymalizowana zgodnie z prostą, jednoetapową techniką przygotowania próbki, która była bardzo odpowiednia do regularnych analiz. 2 mL preparatu odmierzono dokładnie pipetą i przeniesiono do czystej i suchej kolby pomiarowej i rozcieńczono fazą ruchomą do 25 mL. Roztwór ten wstrzykiwano do systemu chromatograficznego po przefiltrowaniu przez filtr membranowy 0,2 μm.

2.2.3. Walidacja metody

Technika wysokosprawnej chromatografii cieczowej do jednoczesnego oznaczania ilościowego RC i DP została przeprowadzona po zastosowaniu metody kalibracji zewnętrznej. Metoda analityczna została zwalidowana na podstawie dokładności, precyzji, liniowości, zakresu i odporności metody. Wiarygodność i dokładność proponowanej metody określono na podstawie badań odzysku. Do roztworu próbki dodawano wzorcowy roztwór podstawowy na trzech różnych poziomach (80%, 110% i 120% wartości oznaczanej dla każdego z RC i DP oznaczanych jako RA, RB, i RC oraz DA, DB, i DC, odpowiednio). Precesję metody badano na podstawie precesji sześciu powtórzonych iniekcji roztworu wzorcowego. Liniowość ustalono poprzez przygotowanie standardowej krzywej liniowości w zakresie stężeń od 10,34 μg-mL-1 do 82,69 μg-mL-1 dla RC i od 10,44 μg-mL-1 do 83,50 μg-mL-1 dla DP (Rysunek 2). Te same krzywe wykorzystano do celów kwantyfikacji. Precyzję śróddzienną obliczono przy użyciu sześciu iniekcji w wyższym zakresie stężeń (41,34 μg-mL-1 dla RC i 41,75 μg-mL-1 dla DP) w tym samym dniu i w różnych dniach, aby uzyskać precyzję śróddzienną. Badanie czystości piku zostało wykorzystane do określenia specyficzności metody. Do tego celu zastosowano detektor z matrycą fotodiodową (PDA) zamiast wspomnianego wcześniej detektora UV, zachowując pozostałe warunki chromatograficzne bez zmian. Granica oznaczalności (LOQ) i granica wykrywalności (LOD) zostały wyznaczone zgodnie z techniką opisaną w innym miejscu. Wytrzymałość metody określono przeprowadzając doświadczenia na aparatach różnych marek. W celu zbadania odporności metody dokonano niewielkich zmian w warunkach chromatograficznych, takich jak skład (±5%) i pH (±0,1%) fazy ruchomej.

(a)
(a)

(b)

(a)
(a)
(b)

Wynik uzyskany z każdego etapu poddano analizie statystycznej w oparciu o oprogramowanie Sigma plot (wersja 8.02 SPSS Inc, USA) oraz MS Excel 2007. Dane rejestrowano w powtórzeniach i przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe z powtórzeń pomiarów.

3. Wyniki i ich omówienie

Średni czas trwania analizy wynosił 28 minut, a średni czas retencji dla RC wynosił minut, a dla DP wynosił minut, a dla RC i DP wynosił minut i minut w roztworach próbek. Zaobserwowano wystarczającą rozdzielczość między RC i DP w chromatogramie wzorcowym i chromatogramie próbki, a blisko eluujące piki wykazały wystarczającą rozdzielczość w chromatogramie próbki (rys. 3 i 4). Prawdopodobnie była to pierwsza opisana technika jednoczesnego oznaczania ilościowego obu substancji z wprowadzonego do obrotu produktu do pielęgnacji włosów. dla RC stwierdzono przy 280 nm, a dla DP przy 210 nm. Dlatego analizę przeprowadzono przy użyciu podwójnego detektora absorbancji lambda z jednoczesnym skanowaniem przy 210 nm i 280 nm. Czystość chromatograficzną dla każdego składnika analizowano przy użyciu detektora PDA dla każdego rozpatrywanego składnika. Kąt czystości piku dla RC i DP wynosił odpowiednio 0,129 i 0,217, a próg czystości piku odpowiednio 0,337 i 0,411. Tak więc piki analitu były symetryczne, czyste i spektralnie jednorodne, a rozdzielczość między odpowiednimi pikami analitu na chromatogramie próbki jest wystarczająca (rys. 3b) i 4b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Rysunek 4

Reprezentatywny chromatogram dla wzorca dekspantenolu (a) i próbki (b).

3.1. Walidacja opracowanej metody

Kwantyfikacja RC została przeprowadzona na podstawie powierzchni piku, a dla DP na podstawie wysokości piku. Omówiona wcześniej metoda analizy została zwalidowana zgodnie z wytycznymi USP i ICH Q2(R1). Odpowiednie parametry do badań przedstawiono w następujący sposób.

3.1.1. Przydatność systemu

Przydatność systemu chromatograficznego do wykonania analizy badano na podstawie przydatności systemu. Była ona zwykle przedstawiana w kategoriach wydajności kolumny, rozdzielczości, współczynnika pojemności oraz współczynnika ogonowania. Płytki teoretyczne zwykle przedstawiane za pomocą litery „” określają wydajność kolumny, miarę ostrości piku, i były ważne dla wykrywania składników śladowych. Oznaczenie rozdzielczości piku lub współczynnika rozdzielczości „” przeprowadzono w celu zapewnienia, że blisko wymywające się związki były dobrze oddzielone od siebie, w celu zapewnienia ogólnej zdolności rozdzielczej systemu, a także w celu zapewnienia, że wzorce wewnętrzne były dobrze rozdzielone w odniesieniu do piku analitu. Współczynnik pojemności „” był miarą rozkładu masy analitu między fazą stacjonarną i ruchomą. Asymetria piku była zwykle wyrażona w kategoriach współczynnika symetrii lub współczynnika ogona. Wartość jedności była przypisana dla idealnie symetrycznego piku i taka sama wzrasta wraz ze wzrostem ogonowania piku. Dla idealnie symetrycznego piku jego wartość wynosiła jedność i wzrasta wraz ze wzrostem ogonowania. Wyniki zostały podsumowane jako płyty teoretyczne (dla RC i DP), współczynnik pojemności (dla RC i 1,32 dla DP), asymetria piku lub współczynnik ogonowania (dla RC i 0,56 dla DP) (Tabela 3).

3.1.2. Liniowość i zakres

W celu zbadania liniowości metody zastosowano roztwory wzorcowe w zakresie stężeń od 3,08 μg-mL-1 do 24,67 μg-mL-1 dla RC i od 10,44 μg-mL-1 do 83,50 μg-mL-1 dla DP. Wynik uzyskany z analizy wykorzystano do sporządzenia krzywej liniowości. Uzyskana w ten sposób krzywa okazała się liniowa ze współczynnikiem regresji i równaniem dla RC oraz i równaniem dla DP (rys. 2). Granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) wyznaczone na podstawie krzywej liniowości wynosiły odpowiednio 2,19 μg-mL-1 i 6,64 μg-mL-1 dla RC oraz 0,62 μg-mL-1 i 1,89 μg-mL-1 dla DP (tabela 3). Wyniki te wyjaśniły czułość techniki w badanym zakresie analiz.

3.1.3. Dokładność

Dokładność była miarą bliskości wyników badań uzyskanych za pomocą tej procedury w porównaniu z wartością prawdziwą. Konieczne jest ustalenie dokładności procedury w rozważanym zakresie stężeń. W niniejszej pracy dokładność analizowano na podstawie badania odzysku. Dla DP i RC przygotowano trzy różne roztwory o stężeniach odpowiednio 80%, 110% i 120% obliczonego stężenia oznaczanego. Roztwory przygotowano przez dodanie znanej objętości roztworów wzorcowych (roztwory A i B) do odpowiednich roztworów próbek. Wyniki wykazały średni odzysk 100,28% przy % RSD 0,82 dla RC oraz 100,02% i 0,48, odpowiednio, dla DP (Tabela 4). W związku z tym ustalono znaczną dokładność w badanym zakresie.