Abstract

De huidige studie presenteert de gelijktijdige kwantificering van dexpanthenol en resorcinol uit op de markt gebrachte haarverzorgingsformules. Dexpanthenol is vaak aanwezig als actief ingrediënt in persoonlijke verzorgingsproducten vanwege zijn verfraaiende en verkwikkende eigenschappen en zijn herstellende en gladmakende eigenschappen. Anderzijds wordt resorcinol voornamelijk voorgeschreven voor de behandeling van seborroïsche dermatitis van de hoofdhuid. De toxische neveneffecten van resorcinol beperken het gebruik ervan in dermatologische preparaten. Daarom kan een nauwkeurige kwantificeringstechniek voor de gelijktijdige schatting van deze twee componenten nuttig zijn voor de formuleringsindustrieën voor een nauwkeurige analyse van hun productkwaliteit. In de huidige studie is een vloeistofchromatografische techniek met hoge prestaties ontwikkeld met een C18-kolom en een mobiele fase bestaande uit fosfaatbuffer van pH = 2,8 met een gradiëntelutie. De stroomsnelheid van de mobiele fase was 0,6 ml per minuut en de detectiegolflengte was 210 nm voor dexpanthenol en 280 nm voor resorcinol. De lineariteitsstudie werd uitgevoerd met vijf oplossingen waarvan de concentraties varieerden tussen 10,34 μg-mL-1 en 82,69 μg-mL-1 () voor resorcinol en 10,44 μg-mL-1 en 83,50 μg-mL-1 () voor dexpanthenol. De methode is gevalideerd volgens de ICH Q2(R1)-richtsnoeren. Het gemak van monstervoorbereiding in één stap, de nauwkeurigheid en precisie (intra- en interdag) studie maakt de methode geschikt voor de gelijktijdige kwantificering van dexpanthenol en resorcinol van alle persoonlijke verzorgingsproducten en dermatologische preparaten die deze twee ingrediënten bevatten.

1. Inleiding

Dexpanthenol (DP) is het alcoholische analoog van D-pantotheenzuur. Chemisch gezien is het 2,4-dihydroxy-N-(3-hydroxypropyl)-3,3-dimethyl-1-butaanamide dat gewoonlijk als actief bestanddeel in een aantal vitamine B-complex supplementen en cosmetica (crèmes, zalven, lotions, enz.) aanwezig is om zijn verfraaiende en verkwikkende eigenschappen en zijn herstellende en gladmakende eigenschappen . DP wordt door de huid opgenomen en omgezet in zijn actieve vorm, pantotheenzuur (vitamine B5), de precursor voor de biosynthese van co-enzym A. De zure vorm speelt een belangrijke rol in de Krebs Cyclus . Pantotheenzuur wordt ook beschouwd als “antistressvitamine”, omdat een tekort eraan kan leiden tot verschillende soorten ziekten, zoals huidirritatie, dermatitis, depigmentatie van het haar, en verstopte groei . In dermatologische preparaten wordt het gewoonlijk in een concentratie van 2 tot 5% gegeven. Vanwege zijn herstellende, gladmakende eigenschappen en zijn anti-dermatitis en depigmenterende eigenschappen wordt het vaak gebruikt in haarverzorgingsprodukten en sommige vitamineformuleringen.

De volgende kandidaat die wij bestuderen is resorcinol (RC) of benzeen-1,3-diol. Het heeft een aantal farmaceutische toepassingen zoals de behandeling van acaïne, seborroïsche dermatitis, eczeem, psoriasis en andere huidaandoeningen. Het wordt ook gebruikt in haarkleurmiddelen. Deze molecule heeft echter een aantal neveneffecten bij langdurig gebruik of in hoge doses. Uit onderzoek blijkt dat langdurig gebruik van RC leidt tot omkeerbare effecten op de menselijke schildklier die resulteren in hypothyreoïdie. Daarom is een exacte methode voor de kwantificering van RC uit formuleringen die voor medicinaal en cosmetisch gebruik worden voorgeschreven, van essentieel belang.

Verschillende cosmetische en farmaceutische preparaten bevatten zowel RC als DP, hetzij in de vorm van hulpstoffen of als actieve bestanddelen, en er zijn zeer weinig methoden gerapporteerd voor de kwantificering daarvan uit dergelijke formuleringen. De meeste van de gerapporteerde technieken presenteren opnieuw methoden voor hetzij RC, hetzij DP. De meeste methoden die voor de kwantificering van RC zijn beschreven, zijn spectrofotometrische technieken en er zijn slechts zeer weinig chromatografische technieken gerapporteerd. In een andere studie die in ons laboratorium werd uitgevoerd hebben wij een techniek ontwikkeld voor de kwantificering van RC alleen uit een op de markt gebracht haarverzorgingsproduct met gebruikmaking van een isocratische elutietechniek met vloeistofchromatografie . Deze methode is echter niet geschikt voor de kwantificering van DP uit dergelijke formuleringen, hetgeen ons heeft geïnspireerd tot de ontwikkeling van deze nieuwere techniek. Voor DP is slechts één gevalideerde superkritische vloeistofchromatografische methode gerapporteerd. De methode beschrijft de kwantificering van de actieve D-vorm in een racemisch mengsel van D- en L-vormen van panthenol uit cosmetische formuleringen met behulp van een massaspectroscopische detector. In de huidige studie wordt een eenvoudige, snelle, nauwkeurige en gevalideerde techniek gepresenteerd voor de gelijktijdige kwantificering van zowel DP als RC uit een op de markt gebracht haarverzorgingsproduct, in aanwezigheid van een complexe matrix bestaande uit glycerine, ethanol, biotine, keratinehydrolysaat, hyalkyl HBU, nicotinezuur, en polyvinylpyrrolidon.

2. Materiaal en Methoden

Dexpanthenol (DP) standaard (zuiverheid 99,65%) en resorcinol (RC) standaard (zuiverheid 99,98%) werden gekocht van Sigma Aldrich India Ltd. Haarverzorgingsformuleringen met DP en RC met batchnummer HV1124, productiedatum februari 2015 en vervaldatum juli 2017 werden gebruikt als een representatieve op de markt gebrachte formulering voor de studie. Oplosmiddelen van chromatografiekwaliteit werden gekocht bij Spectrochem India Limited. Een C18-kolom met een lengte van 100 mm en een inwendige diameter van 4,0 mm werd aangekocht bij Waters Limited (Waters MA, VS). Alle bij de analyse gebruikte reagentia werden aangekocht bij Merck India Limited. Apparatuur en chromatografische omstandigheden

Een Waters Alliance Separation Module (Waters, USA) quaternaire gradiëntsysteem en Waters 2489 dubbele lambda-absorptiedetector werden gebruikt voor de kwantificering. De analyse werd uitgevoerd met behulp van Empower 3-software (Waters, VS). Voor de analyse werd gebruik gemaakt van een omgekeerde fase Waters C18-kolom (Waters, USA) met een lengte van 100 mm, een interne diameter van 4,0 mm, een deeltjesgrootte van 5 μm en een gradiënt-elutiedebiet van 0,6 mL/min. De mobiele fase was een combinatie van gefilterde en ontgaste 5,4 mM fosfaatbuffer (pH = 2,8) en acetonitril (ACN) in de in tabel 1 aangegeven verhoudingen.

De analyse werd uitgevoerd bij omgevingstemperatuur en het injectievolume bedroeg 20 μL. De detectiegolflengte was 210 nm voor DP en 280 nm voor RC. Vóór de chromatografische scheiding werden zowel de standaard- als de monsteroplossingen gefiltreerd over een 0,2 μm membraanfilter (Pall Life science, India). Bereiding van standaardoplossingen en monsteroplossingen

2.2.1. Standaardoplossing

De RC- en DP-stamoplossingen werden bereid door 51,68 mg RC (oplossing A) en 52,19 mg DP (oplossing B) op te lossen in 100 mL verdunningsmiddel (90% buffer en 10% acetonitril) in twee afzonderlijke schone en droge maatkolven met behulp van ultrageluid. Oplossing A werd verdund tot het bereik 10,34 μg-mL-1 tot 82,69 μg-mL-1 en oplossing B 10,44 μg-mL-1 tot 83,50 μg-mL-1 met behulp van de verdunningsmiddelen voor de analyse (tabel 1). Piekoppervlak versus concentratie curve werd voorbereid (figuur 1 (a) voor RC en figuur 1 (b) voor DP) en werd gebruikt voor het bepalen van de lineariteit van de methode en hetzelfde werd gebruikt voor de kwantificering doel. De resultaten zijn weergegeven in tabel 2 (a en b) voor respectievelijk RC en DP. De fitting van de kromme werd uitgevoerd volgens de kleinste-kwadratenmethode.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figuur 1

Chemische structuur van resorcinol (a) en dexpanthenol (b).

2.2.2. Monsteroplossing

De bereiding van de monsteroplossing was kritisch wanneer in de matrix een aantal storende stoffen aanwezig waren, zoals glycerine, ethanol, biotine, keratinehydrolysaat, hyalkyl HBU, nicotinezuur, en polyvinylpyrrolidon. In onze studie is de methode echter geoptimaliseerd volgens een eenvoudige monstervoorbereidingstechniek in één stap, die zeer geschikt was voor de regelmatige analyse. 2 ml van de formulering werd nauwkeurig gepipetteerd en overgebracht in een schone en droge maatkolf en verdund tot 25 ml met mobiele fase. Deze oplossing werd in het chromatografische systeem geïnjecteerd na filtering door een 0,2 μm membraanfilter.

2.2.3. Methodevalidatie

De hogedrukvloeistofchromatografietechniek voor de gelijktijdige kwantificering van RC en DP werd uitgevoerd volgens de externe ijkmethode . De analysemethode werd gevalideerd op basis van de nauwkeurigheid, de precisie, de lineariteit, het bereik en de robuustheid van de methode. De betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van de voorgestelde methode werden bepaald op basis van terugvindingsstudies. De monsteroplossing werd verrijkt met standaard stockoplossing op drie verschillende niveaus (80%, 110% en 120% van de analysewaarde voor elk van RC en DP, respectievelijk aangeduid als RA, RB en RC en DA, DB en DC). De precessie van de methode is bestudeerd aan de hand van de precessie van zes replicaatinjecties van de standaardoplossing. De lineariteit werd vastgesteld door voorbereiding van standaard lineariteitscurve in het concentratiebereik van 10,34 μg-mL-1 tot 82,69 μg-mL-1 voor RC en 10,44 μg-mL-1 tot 83,50 μg-mL-1 voor DP (figuur 2). Dezelfde curven werden gebruikt voor de kwantificering. De intraday-precisie werd berekend aan de hand van zes injecties in het hogere concentratiebereik (41,34 μg-mL-1 voor RC en 41,75 μg-mL-1 voor DP) op dezelfde dag en op verschillende dagen om de interday-precisie te verkrijgen. De piekzuiverheidsstudie werd gebruikt om de specificiteit van de methode te bepalen. In plaats van de eerder genoemde UV-detector werd hiervoor een fotodiode-arraydetector (PDA) gebruikt, waarbij de overige chromatografische omstandigheden ongewijzigd bleven. De bepaalbaarheidsgrens (LOQ) en de aantoonbaarheidsgrens (LOD) werden bepaald volgens de elders beschreven techniek. De robuustheid van de methode werd bepaald door experimenten uit te voeren op instrumenten van verschillende merken. Geringe wijzigingen in de chromatografische omstandigheden zoals samenstelling (±5%) en pH (±0,1%) van de mobiele fase werden aangebracht om de robuustheid van de methode te bestuderen.

(a)

(b)

(a)
(b)

De uit elke fase verkregen resultaten werden onderworpen aan statistische analyse met behulp van Sigma plot software (versie 8.02 SPSS Inc, USA) en MS Excel 2007. De gegevens werden geregistreerd in herhalingen en gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking van de metingen in herhalingen.

3. Resultaten en Discussies

De gemiddelde runtime voor analyse was 28 minuten en de gemiddelde retentietijd voor RC was minuten en voor DP was minuten en voor RC en DP was minuten en minuten in monsteroplossingen. Er werd voldoende resolutie waargenomen tussen RC en DP in het standaardchromatogram en het monsterchromatogram en de dicht bij elkaar liggende eluerende pieken vertoonden voldoende resolutie in het monsterchromatogram (figuren 3 en 4). Dit was waarschijnlijk de eerste gerapporteerde techniek voor de gelijktijdige kwantificering van beide uit op de markt gebrachte haarverzorgingsprodukten. voor RC werd gevonden bij 280 nm en voor DP bij 210 nm. Daarom werd de analyse uitgevoerd met een dubbele lambda-absorptiedetector met gelijktijdige aftasting bij 210 nm en 280 nm. De chromatografische zuiverheid voor elk bestanddeel werd geanalyseerd met behulp van een PDA-detector voor elk onderzocht bestanddeel. De piekzuiverheidshoek voor RC en DP was respectievelijk 0,129 en 0,217, en de piekzuiverheidsdrempel was respectievelijk 0,337 en 0,411. De analytpieken waren dus symmetrisch, zuiver en spectraal homogeen en er is voldoende resolutie tussen de respectieve analytpieken in het monsterchromatogram (figuren 3(b) en 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

(a)

(b)

(a)
(b)

3.1. Validatie van de ontwikkelde methode

De kwantificering van RC werd uitgevoerd op basis van de piekoppervlakte en voor DP op basis van de piekhoogte. De eerder besproken analysemethode werd gevalideerd volgens de richtlijnen van USP en ICH Q2(R1). De respectieve parameters voor het onderzoek werden als volgt gepresenteerd.

3.1.1. Geschiktheid van het systeem

De geschiktheid van het chromatografiesysteem voor het uitvoeren van de analyse werd bestudeerd aan de hand van de geschiktheid van het systeem. Deze werd gewoonlijk weergegeven in termen van kolomrendement, resolutie, capaciteitsfactor en residufactor. De theoretische platen die gewoonlijk met de letter “” worden aangegeven, geven het rendement van de kolom aan, een maat voor de scherpte van de pieken, en waren belangrijk voor de detectie van sporencomponenten. De piekresolutie of resolutiefactor werd bepaald om ervoor te zorgen dat de nauw eluerende verbindingen goed van elkaar gescheiden werden, om het algemene oplossende vermogen van het systeem te waarborgen en ook om ervoor te zorgen dat de interne standaarden goed werden opgelost voor de analytpiek. De capaciteitsfactor was een maat voor de massaverdeling van de analyt tussen de stationaire en de mobiele fase. De asymmetrie van de piek werd meestal uitgedrukt als symmetrie- of staartfactor. Een waarde van eenheid werd toegekend voor een perfect symmetrische piek en deze waarde neemt toe met de toename van de piekstaart. Voor een perfect symmetrische piek werd een waarde van eenheid toegekend en dezelfde waarde neemt toe naarmate de staartvorming uitgesprokener wordt. De resultaten werden samengevat als theoretische platen ( voor RC en voor DP), capaciteitsfactor ( voor RC en 1,32 voor DP), piekasymmetrie, of staartfactor ( voor RC en 0,56 voor DP) (tabel 3) .

3.1.2. Lineariteit en bereik

Om de lineariteit van de methode te bestuderen, werden standaardoplossingen in een concentratiebereik van 3,08 μg-mL-1 tot 24,67 μg-mL-1 voor RC en 10,44 μg-mL-1 tot 83,50 μg-mL-1 voor DP gebruikt. Het resultaat van de analyse werd gebruikt om de lineariteitscurve te bereiden. De aldus verkregen curve bleek lineair te zijn met regressiefactor en vergelijking voor RC en en vergelijking voor DP (figuur 2). De aantoonbaarheidsgrens (LOD) en de bepaalbaarheidsgrens (LOQ) die met behulp van de lineariteitscurve werden bepaald, bedroegen respectievelijk 2,19 μg-mL-1 en 6,64 μg-mL-1 voor RC en 0,62 μg-mL-1 en 1,89 μg-mL-1 voor DP (tabel 3). De resultaten verklaren de gevoeligheid van de techniek binnen het onderzochte analysebereik. Nauwkeurigheid

De nauwkeurigheid was een maatstaf voor de mate van overeenstemming tussen de met deze procedure verkregen testresultaten en de werkelijke waarde. Het is noodzakelijk de nauwkeurigheid van de procedure in het beschouwde concentratiebereik vast te stellen. In deze studie werd de nauwkeurigheid geanalyseerd aan de hand van een terugvindingsstudie. Voor DP en RC werden drie verschillende oplossingen bereid met een concentratie van respectievelijk 80%, 110% en 120% van de berekende assayconcentratie. De oplossingen werden bereid door een bekend volume van de standaardoplossingen (oplossingen A en B) toe te voegen aan de respectieve monsteroplossingen. De resultaten gaven een gemiddelde terugvinding van 100,28% met % RSD 0,82 voor RC en 100,02% en 0,48, respectievelijk, voor DP (tabel 4). Er werd dus een aanzienlijke nauwkeurigheid vastgesteld over het gehele bestudeerde bereik.

3.1.4. Precessie

In onze studie werd de precessie vastgesteld aan de hand van de standaardafwijking of relatieve standaardafwijking van een reeks metingen zoals herhaalbaarheid en tussentijdse precessie van de ontwikkelde techniek. Voor de studie van de herhaalbaarheid werden zes monsteroplossingen bij 100% van de testconcentratie afzonderlijk bereid en geanalyseerd met de bestudeerde analytische procedure. Dezelfde monsteroplossing werd gedurende drie opeenvolgende dagen in drievoud geïnjecteerd en het aldus verkregen resultaat werd gebruikt om de tussentijdse precessie te bepalen. De intraday-precessie vertoonde een RSD-waarde van 0,19 en die voor interday varieerde alleen voor RC van 0,19% tot 0,21% en voor DP van 0,20 en 0,11 tot 0,19, zodat de analytische procedure binnen het bestudeerde bereik nauwkeurig was (tabel 2).

3.1.5. Specificiteit

De ondubbelzinnige bepaling van de analyt in kwestie uit een mengsel van componenten zoals onzuiverheden, afbraakproducten en matrixcomponenten wordt specificiteit genoemd. In deze studie werd de specificiteit van zowel DP als RC bepaald op basis van chromatografisch piekzuiverheidsonderzoek van monsteroplossingen. Een piek werd alleen als spectraal homogeen beschouwd, d.w.z. vrij van coelutie, wanneer de piekzuiverheidshoek kleiner was dan de drempelwaarde. Uit de studie bleek dat de piekzuiverheidshoek voor RC en DP respectievelijk 0,129 en 0,217 was, en de piekzuiverheidsdrempel respectievelijk 0,337 en 0,411 (tabel 3). Derhalve werd geconcludeerd dat de respectieve pieken spectraal homogeen waren, vrij van enige coeluterende onzuiverheden, en specifiek voor de gelijktijdige analyse van zowel RC als DP.

3.1.6. Robuustheid

De robuustheid werd gewoonlijk gedefinieerd als het vermogen van een analytische procedure om onaangetast te blijven bij de invoering van kleine maar opzettelijke variaties van de procedureparameters die in de proceduredocumentatie zijn vermeld en een indicatie geven van de stabiliteit van de procedure bij regelmatige analyse. De robuustheid van de huidige methode werd bestudeerd aan de hand van variaties in de analist, de instrumenten en de stabiliteit van de oplossing, alsmede aan de hand van verschillende opslagcondities. De resultaten bleken binnen de tolerantiegrenzen te liggen (tabel 5).

De huidige methode bleek robuust te zijn voor de gelijktijdige kwantificering van RC en DP (tabel 5) bij concentraties van slechts 6,64 μg-mL-1 voor RC en 1,89 μg-mL-1 voor DP.89 μg-mL-1 voor DP (tabel 2).

4. Conclusie

De omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografische techniek ontwikkeld in de huidige studie was eenvoudig in termen van monstervoorbereiding en analyse, gevoelig en selectief voor de gelijktijdige kwantificering van zowel resorcinol als dexpanthenol, en nauwkeurig en accuraat voor hun gelijktijdige kwantificering uit een complexe matrix. De methode is gevalideerd in termen van nauwkeurigheid, precessie, lineariteit en gevoeligheid volgens de ICH Q2(R1)-richtsnoeren. De respectieve retentietijd voor DP en RC was 3,19 minuten en 7,2 minuten. De pieken waren goed van elkaar gescheiden en ook van andere dicht bij elkaar liggende pieken. Aldus is de huidige methode geschikt voor routineanalyse, stabiliteitstests, en gelijktijdige kwantificering van RC en DP van diverse formuleringen beschikbaar in de markt.

Conflict of Interests

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van deze paper.

Acknowledgments

De auteurs erkennen alle leden van R&D sectie voor hun vriendelijke medewerking en ondersteuning. De auteurs danken ook de directie en de bestuursleden voor hun onschatbare steun en aanmoediging.