プロモーターは、RNAポリメラーゼと転写因子の結合を制御するものである。 プロモーター領域は標的遺伝子の転写を駆動するため、遺伝子発現のタイミングを決定し、生産される組換えタンパク質の量をほぼ決定する。 CMV、EF1A、SV40プロモーターのような一般的なプロモーターの多くは、常に活性であるため、構成的プロモーターと呼ばれる。 また、特定の状況下でのみ活性化するものもある。 この記事では、OFFからONの状態に切り替えることができる誘導性プロモーターについて説明し、研究においてこれらをどのように利用できるかを説明します。 この投稿を読み終えたら、次は抑制性プロモーターについての投稿をご覧ください。
誘導性プロモーターはどのように制御されるのでしょうか。
負の誘導性
OFFの状態では、結合したリプレッサー蛋白が活発に転写を阻害するため、プロモーターは不活性である。 一旦、誘導物質がリプレッサータンパク質に結合すると、リプレッサータンパク質はDNAから除去される。
誘導性プロモーターの種類
化学物質、温度、光はすべてプロモーターを誘導する要因の例である。 以下に、これら 3 種類の誘導性プロモーターの簡単な説明と、各タイプの例を挙げます。 これらのプロモーターシステムの多くは、Addgeneで入手できます！
化学的誘導性プロモーター
化学的に制御されたプロモーターは、最も一般的な誘導性プロモーターの1つです。 原核生物および真核生物で使用するために開発された汎用性の高いツールである正誘導性テトラサイクリンON（Tet-On）システムは、直接活性化によって機能する。 このシステムでは、活性化因子rtTA（reverse tetracycline-controlled transactivator）は通常不活性であり、プロモーター中のテトラサイクリン応答要素（TRE）に結合することができない。 テトラサイクリンとその誘導体はプロモーターの活性化を可能にする誘導剤として働く。
原核生物のプロモーターとして最もよく使われているものに、負の誘導性を持つpLacプロモーターがある。 このプロモーターは、転写が活性化されるために、lacリプレッサー（lacIタンパク質）の除去を必要とする。 ラクトースまたはラクトース類似体IPTGの存在下で、lacリプレッサーは構造変化を起こし、プロモーター内のlacO部位から除去され、標的遺伝子の抑制が停止される。 4230＞＜3909＞陰性誘導性プロモーターpBadは、バクテリアのタンパク質精製によく使われるもう一つの有名な原核生物プロモーターである。 アラビノースがない場合、制御タンパク質AraCがpBadの上流のOとI1部位に結合し、転写を阻害する。 アラビノースの添加により、AraCはI1およびI2部位に結合し、転写が開始される。 アラビノースに加えて、cAMP activator protein (CAP)と複合化したcAMPも、I1およびI2部位へのAraCの結合を刺激することができる。 細胞増殖培地にグルコースを補充すると、cAMPが減少し、pBadが抑制され、プロモーターリークが減少する。
化学的に誘導されるプロモーターの他の例としては、植物研究で一般的に使用されている陽性誘導性アルコールおよびステロイド制御プロモーターがある。
| プロモーターサブタイプ | プロモーター例 | アクチベーター | Addgene Plasmid/Kit | |
| Alcohol-> | ||||
| AlcR |
pGGA008 (AlcA) and pGGC011 (AlcR) from red flame GreenGate kit |
|||
| Steroid- | AlcA プロモーター。regulated | LexA promoter | XVE (synthetic) |
pFZ19 (yellow flame) |
Temperature inducible promoters
温度感受性発現系は、化学的に誘導するプロモータよりもリーキー度が一般的に低くなっています。 常温ではほとんど発現しないが、熱や寒冷にさらされると発現が誘導される。 例えば、熱ショック誘発性のHsp70やHsp90由来のプロモーターは、選択した遺伝子が短時間の熱ショックにさらされた後にのみ発現されるものである。 Hsp70の場合、熱ショックにより熱ショック因子1（HSF-1）が放出され、その後プロモーター内の熱ショックエレメントに結合し、転写が活性化される。 Addgene寄託者は、線虫やショウジョウバエなどの種のゲノムエンジニアリングを容易にするために、熱ショック誘導性のCreやCas9を開発した。
光誘導性プロモーター
光も遺伝子発現を活性化する方法の一つで、合成生物で用いられる2成分系では光を使って転写を制御している。 紅炎プラスミドpDawnには青色光を感知するタンパク質YFIが含まれている。 光がないとき、YFIはFixJをリン酸化し、FixJはFixK2プロモーターに結合して、ファージリプレッサーcIの転写を誘導する。 リプレッサーcIは、ファージプロモーターpRからの転写を阻害し、レポーター遺伝子の発現を阻止する。 光が照射されると、YFIは不活性化し、リプレッサーcIの合成を阻止し、レポーター遺伝子の転写を可能にする。 Addgeneには、Taborラボによって設計されたイエローフレーム光制御2コンポーネントシステムもあります。
どの誘導性プロモーターが自分に合っているか
誘導性プロモーターを選ぶ際に考慮すべき重要な変数のリストがここにあります。 バクテリアのプロモーターは原核細胞でのみ機能し、典型的にはそれらが由来する同一または近縁の種でのみ機能する。 同様に、様々な真核細胞タイプ（哺乳類、酵母、植物など）には固有のプロモーターが必要であり、クロスオーバーはほとんどない。
Leakiness
毒性があるかもしれない遺伝子を発現させる場合、 誘導性プロモーターがあまりリーキーでないことが重要です。 原核生物の誘導性プロモーターでは、pLac がややリーキーであることが知られており、グルコースで発現を抑制できる pBad がより良い選択肢であると思われます。
Inducibility level
どの程度、標的遺伝子の転写を誘導したいか。 誘導性プロモーターの強さは千差万別です。 高い誘導性を求めるのであれば、活性化すると>1,000倍の転写を誘導することが記録されているTet-On系が良いかもしれない
Lag time
あるプロモーターが誘導されるのに要する時間は様々である。 Tetシステムのように外部からの誘導剤を加えるだけで活性化するプロモーターは、非常に短時間で活性化することができる。 一方、リプレッサー/インデューサーの転写を必要とするプロモーターシステムは、転写/翻訳に必要な時間がかかるため、ラグタイムが長くなる。
この記事の執筆に協力していただいたNicole Zurcher氏に感謝します。
Addgene Blogのその他のリソース:
- Plasmids 101: The Promoter Region
- Plasmids 101: Cre-lox
- Light-Switchable Two-Component Systems for E. coli
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