Abstract

Lo studio attuale presenta la quantificazione simultanea di dexpantenolo e resorcinolo da formulazioni per la cura dei capelli commercializzate. Il dexpantenolo è spesso presente come ingrediente attivo nei prodotti per la cura personale per le sue proprietà abbellenti e tonificanti e per le sue proprietà riparatrici e leviganti. D’altra parte il resorcinolo è principalmente prescritto per il trattamento della dermatite seborroica del cuoio capelluto. Gli effetti collaterali tossici del resorcinolo ne limitano l’uso nelle preparazioni dermatologiche. Pertanto, una tecnica di quantificazione accurata per la stima simultanea di questi due componenti può essere utile alle industrie di formulazione per l’analisi accurata della qualità dei loro prodotti. Nel presente studio è stata sviluppata una tecnica cromatografica liquida ad alte prestazioni utilizzando una colonna C18 e una fase mobile costituita da tampone fosfato a pH = 2,8 con eluizione a gradiente. La velocità di flusso della fase mobile era di 0,6 mL al minuto e la lunghezza d’onda di rilevazione era di 210 nm per il dexpantenolo e 280 nm per il resorcinolo. Lo studio di linearità è stato effettuato utilizzando cinque soluzioni con concentrazioni comprese tra 10,34 μg-mL-1 e 82,69 μg-mL-1 () per il resorcinolo e 10,44 μg-mL-1 e 83,50 μg-mL-1 () per il dexpantenolo. Il metodo è stato convalidato secondo le linee guida ICH Q2(R1). La facilità di preparazione del campione in un unico passaggio, l’accuratezza e la precisione (intraday e interday) presentano il metodo adatto per la quantificazione simultanea di dexpantenolo e resorcinolo da qualsiasi prodotto per la cura personale e preparati dermatologici contenenti questi due ingredienti.

1. Introduzione

Il dexpantenolo (DP) è l’analogo alcolico dell’acido D-pantotenico. Chimicamente è 2,4-diidrossi-N-(3-idrossipropil)-3,3-dimetil-1-butanamide comunemente presente come ingrediente attivo in un certo numero di integratori di vitamina B-complex e nei cosmetici (creme, unguenti, lozioni, ecc.) per le sue proprietà abbellenti e tonificanti e le proprietà riparatrici e leviganti. Il DP viene assorbito attraverso la pelle e viene convertito nella sua forma attiva, l’acido pantotenico (vitamina B5), il precursore della biosintesi del coenzima A. La forma acida svolge un ruolo importante nel ciclo di Krebs. L’acido pantotenico è anche considerato come “vitamine antistress” in quanto la sua carenza può provocare diversi tipi di malattie come irritazione della pelle, dermatiti, depigmentazione dei capelli e crescita stentata. Nelle preparazioni dermatologiche è di solito dato in forze dal 2 al 5%. Grazie alle sue proprietà riparatrici, leviganti, antidermatite e depigmentazione è spesso usato nei prodotti per la cura dei capelli e in alcune formulazioni vitaminiche.

Il prossimo candidato al nostro studio è il resorcinolo (RC) o benzene-1,3-diolo. Ha una serie di applicazioni farmaceutiche come il trattamento di acaina, dermatite seborroica, eczema, psoriasi e altri disturbi della pelle. È anche usato nei coloranti per capelli. Tuttavia, questa molecola ha una serie di effetti collaterali sull’uso a lungo termine o in grandi dosi. La ricerca mostra che un uso a lungo termine di RC porta ad effetti reversibili sulla tiroide umana con conseguente ipotiroidismo. Pertanto un metodo esatto per la quantificazione di RC da formulazioni prescritte per uso medicinale e cosmetico è essenziale.

Diverse preparazioni cosmetiche e farmaceutiche contengono sia RC che DP sotto forma di eccipienti o come componenti attivi e pochissimi metodi sono stati riportati per la loro quantificazione da tali formulazioni. Anche in questo caso la maggior parte delle tecniche riportate presenta metodi per RC o DP. La maggior parte dei metodi descritti per la quantificazione di RC sono tecniche spettrofotometriche e pochissime tecniche cromatografiche riportate. In un altro studio condotto nel nostro laboratorio abbiamo sviluppato una tecnica per la quantificazione di RC solo da un prodotto per capelli commercializzato utilizzando una tecnica di eluizione isocratica con cromatografia liquida. Questo metodo non è tuttavia adatto per la quantificazione di DP da tale formulazione che ci ha ispirato per lo sviluppo di questa nuova tecnica. Per il DP solo un singolo metodo cromatografico del liquido supercritico convalidato è stato segnalato. Il metodo descrive la quantificazione della forma D attiva in una miscela racemica delle forme D e L del pantenolo dalla formulazione cosmetica usando un rivelatore spettroscopico di massa. Nel presente studio viene presentata una tecnica semplice, rapida, precisa e convalidata per la quantificazione simultanea di DP e RC da un prodotto per la cura dei capelli commercializzato, in presenza di una matrice complessa che comprende glicerina, etanolo, biotina, cheratina idrolizzata, hyalkyl HBU, acido nicotinico e polivinilpirrolidone.

2. Materiale e metodi

Il DP (DP) standard (purezza 99,65%) e il resorcinolo (RC) standard (purezza 99,98%) sono stati acquistati da Sigma Aldrich India Ltd. La formulazione per la cura dei capelli contenente DP e RC con numero di lotto HV1124, data di produzione febbraio 2015 e data di scadenza luglio 2017 è stata utilizzata come formulazione rappresentativa commercializzata per lo studio. I solventi di grado cromatografico sono stati acquistati da Spectrochem India Limited. Una colonna C18 di 100 mm di lunghezza e 4,0 mm di diametro interno è stata acquistata da Waters Limited (Waters MA, USA). Tutti i reagenti utilizzati nell’analisi sono stati acquistati da Merck India Limited.

2.1. Attrezzatura e condizioni cromatografiche

A Waters Alliance Separation Module (Waters, USA) sistema a gradiente quaternario e Waters 2489 doppio rivelatore di assorbanza lambda sono stati utilizzati per la quantificazione. L’analisi è stata effettuata utilizzando il software Empower 3 (Waters, USA). Per l’analisi è stata utilizzata una colonna Waters C18 a fase inversa (Waters, USA) con lunghezza di 100 mm, diametro interno di 4,0 mm, dimensione delle particelle di 5 μm e un flusso di eluizione a gradiente di 0,6 mL/min. La fase mobile era una combinazione di tampone fosfato 5,4 mM filtrato e degassato (pH = 2,8) e acetonitrile (ACN) nelle proporzioni presentate nella tabella 1.

L’analisi è stata effettuata a temperatura ambiente e il volume di iniezione era di 20 μL. La lunghezza d’onda di rilevamento era di 210 nm per DP e 280 nm per RC. Prima della separazione cromatografica sia le soluzioni standard che quelle campione sono state filtrate attraverso un filtro a membrana da 0,2 μm (Pall Life science, India).

2.2. Preparazione delle soluzioni standard e delle soluzioni campione

2.2.1. Soluzione standard

Le soluzioni stock RC e DP sono state preparate sciogliendo 51,68 mg di RC (soluzione A) e 52,19 mg di DP (soluzione B) in 100 mL di diluenti (90% tampone e 10% acetonitrile) in due matracci volumetrici separati puliti e asciutti, utilizzando gli ultrasuoni. La soluzione A è stata diluita nell’intervallo da 10,34 μg-mL-1 a 82,69 μg-mL-1 e la soluzione B da 10,44 μg-mL-1 a 83,50 μg-mL-1 utilizzando i diluenti per l’analisi (tabella 1). Area di picco contro la curva di concentrazione è stato preparato (Figura 1 (a) per RC e Figura 1 (b) per DP) ed è stato utilizzato per la determinazione della linearità del metodo e lo stesso è stato utilizzato per lo scopo di quantificazione. I risultati sono stati presentati nella tabella 2 (a e b) per RC e DP, rispettivamente. L’adattamento della curva è stato effettuato seguendo il metodo dei minimi quadrati.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 1

Struttura chimica di resorcinolo (a) e dexpantenolo (b).

2.2.2. Soluzione campione

La preparazione della soluzione campione era critica quando nella matrice erano presenti diverse sostanze interferenti come glicerina, etanolo, biotina, idrolizzato di cheratina, hyalkyl HBU, acido nicotinico e polivinilpirrolidone. Tuttavia, nel nostro studio, il metodo è stato ottimizzato seguendo una semplice tecnica di preparazione del campione in un unico passaggio, molto adatto per l’analisi regolare. 2 mL della formulazione sono stati pipettati accuratamente e trasferiti in un pallone volumetrico pulito e asciutto e diluiti a 25 mL con la fase mobile. Questa soluzione è stata iniettata nel sistema cromatografico dopo il filtraggio attraverso un filtro a membrana da 0,2 μm.

2.2.3. Validazione del metodo

La tecnica di cromatografia liquida ad alte prestazioni per la quantificazione simultanea di RC e DP è stata eseguita seguendo il metodo di calibrazione esterna. Il metodo analitico è stato convalidato sulla base di accuratezza, precisione, linearità, range e robustezza del metodo. L’affidabilità e l’accuratezza del metodo proposto sono state determinate sulla base di studi di recupero. La soluzione campione è stata dosata con una soluzione standard stock a tre diversi livelli (80%, 110% e 120% del valore di dosaggio per ogni RC e DP etichettati come RA, RB e RC e DA, DB e DC, rispettivamente). La precessione del metodo è stata studiata sulla base della precessione di sei iniezioni replicate della soluzione standard. La linearità è stata stabilita attraverso la preparazione della curva di linearità standard nell’intervallo di concentrazione da 10,34 μg-mL-1 a 82,69 μg-mL-1 per RC e da 10,44 μg-mL-1 a 83,50 μg-mL-1 per DP (Figura 2). Le stesse curve sono state utilizzate per la quantificazione. La precisione infragiornaliera è stata calcolata utilizzando sei iniezioni all’intervallo di concentrazione superiore (41,34 μg-mL-1 per RC e 41,75 μg-mL-1 per DP) nello stesso giorno e in giorni diversi per ottenere la precisione infragiornaliera. Lo studio della purezza del picco è stato utilizzato per determinare la specificità del metodo. Allo scopo è stato utilizzato un rivelatore a matrice di fotodiodi (PDA) al posto del rivelatore UV menzionato in precedenza, mantenendo inalterate le altre condizioni cromatografiche. Il limite di quantificazione (LOQ) e il limite di rilevazione (LOD) sono stati determinati seguendo la tecnica descritta altrove. La robustezza del metodo è stata determinata effettuando esperimenti su strumenti di diversa marca. Lievi cambiamenti nelle condizioni cromatografiche come la composizione (±5%) e il pH (±0,1%) della fase mobile sono stati fatti al fine di studiare la robustezza del metodo.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 2

Curva di concentrazione rispetto all’area di picco per l’analisi RC (a) e DP (b).

Il risultato ottenuto da ogni fase è stato sottoposto ad analisi statistica basata sul software Sigma plot (versione 8.02 SPSS Inc, USA) e MS Excel 2007. I dati sono stati registrati in repliche e presentati come media ± deviazione standard delle misure replicate.

3. Risultati e discussioni

Il tempo medio di esecuzione dell’analisi è stato di 28 minuti e il tempo di ritenzione medio per RC era di minuti e per DP era di minuti e per RC e DP era di minuti e minuti nelle soluzioni campione. È stata osservata una risoluzione sufficiente tra RC e DP nel cromatogramma standard e nel cromatogramma del campione e i picchi a eluizione ravvicinata hanno mostrato una risoluzione sufficiente nel cromatogramma del campione (figure 3 e 4). Questa è stata probabilmente la prima tecnica riportata per la quantificazione simultanea di entrambi dal prodotto per la cura dei capelli commercializzato. per RC è stato trovato a 280 nm e per DP a 210 nm. Pertanto l’analisi è stata effettuata utilizzando un rilevatore di assorbanza a doppia lambda con scansione simultanea a 210 nm e 280 nm. La purezza cromatografica per ogni componente è stata analizzata utilizzando un rivelatore PDA per ogni componente in esame. L’angolo di purezza del picco per RC e DP era 0,129 e 0,217, rispettivamente, e la soglia di purezza del picco era 0,337 e 0,411, rispettivamente. Quindi i picchi dell’analita erano simmetrici, puri e spettralmente omogenei e c’è una risoluzione sufficiente tra i rispettivi picchi dell’analita nel cromatogramma del campione (Figure 3(b) e 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 3

Cromatogrammi rappresentativi per il resorcinolo standard (a) e il campione (b).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 4

Cromatogramma rappresentativo per dexpantenolo standard (a) e campione (b).

3.1. Convalida del metodo sviluppato

La quantificazione di RC è stata effettuata sulla base dell’area del picco e per DP sulla base dell’altezza del picco. Il metodo di analisi discusso in precedenza è stato convalidato secondo le linee guida USP e ICH Q2(R1). I rispettivi parametri di studio sono stati presentati come segue.

3.1.1. Idoneità del sistema

L’idoneità del sistema cromatografico per l’esecuzione dell’analisi è stata studiata sulla base dell’idoneità del sistema. Di solito è stata rappresentata in termini di efficienza della colonna, risoluzione, fattore di capacità e fattore di coda. Le piastre teoriche solitamente presentate con la lettera “” definiscono l’efficienza della colonna, una misura per la nitidezza dei picchi, e sono importanti per la rilevazione di componenti in tracce. La determinazione della risoluzione del picco o del fattore di risoluzione “” è stata effettuata per garantire che i composti in stretta eluizione fossero ben separati gli uni dagli altri, per garantire il potere risolutivo generale del sistema e anche per garantire che gli standard interni fossero ben risolti per il picco dell’analita. Il fattore di capacità “” era una misura per la distribuzione della massa dell’analita tra la fase stazionaria e la fase mobile. L’asimmetria del picco era solitamente espressa in termini di fattore di simmetria o fattore di coda. Un valore di unità è stato assegnato per un picco perfettamente simmetrico e lo stesso aumenta con l’aumento del tailing del picco. Per un picco perfettamente simmetrico il suo valore era pari all’unità e lo stesso aumenta con l’aumentare del pedinamento. I risultati sono stati riassunti come piastre teoriche (per RC e per DP), fattore di capacità (per RC e 1,32 per DP), asimmetria del picco o fattore di pedinamento (per RC e 0,56 per DP) (Tabella 3).

Parametri Resorcinolo Despantenolo Adeguatezza del sistema Tempo di ritenzione (min) 7.19 3.19 Fattore di capacità 1.08 1.32 Risoluzione di picco 15.41 – Fattore di coda 0.97 0.56 Piastre teoriche () Sensibilità LOD (µg-mL-1) 2.19 0.62 LOQ (µg-mL-1) 6.64 1.89 Precisione Intraday Contenuto medio (mg/100 mL) () ± % RSD 50.41 ± 0.19 49.77 ± 0.20 Intervallo Contenuto medio (mg/100 mL) (giorno 1/giorno 2/giorno 3) () 50.40/50.38/50.39 49.76/49.78/49.65 (% RSD) (giorno 1/giorno 2/giorno 3) () 0.20/0.19/0.21 0.11/0.19/0.15 Specificità Angolo di purezza di picco 0.129 0.217 Soglia di purezza di picco 0.337 0.411

Rispetto al DP.

Tabella 3

Adeguatezza del sistema e dati di validazione del metodo per la quantificazione simultanea di DP e RC.

3.1.2. Linearità e intervallo

Per studiare la linearità del metodo, sono state utilizzate soluzioni standard in un intervallo di concentrazione da 3,08 μg-mL-1 a 24,67 μg-mL-1 per RC e da 10,44 μg-mL-1 a 83,50 μg-mL-1 per DP. Il risultato ottenuto dall’analisi è stato utilizzato per preparare la curva di linearità. La curva così ottenuta è risultata essere lineare con fattore di regressione ed equazione per RC e ed equazione per DP (Figura 2). Il limite di rilevamento (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) determinati utilizzando la curva di linearità erano 2,19 μg-mL-1 e 6,64 μg-mL-1 per RC, 0,62 μg-mL-1 e 1,89 μg-mL-1 per DP, rispettivamente (Tabella 3). I risultati hanno spiegato la sensibilità della tecnica all’interno dell’intervallo di analisi in esame.

3.1.3. Accuratezza

L’accuratezza era una misura della vicinanza dei risultati delle analisi ottenuti con quella procedura rispetto al valore vero. È necessario stabilire l’accuratezza della procedura nell’intervallo di concentrazione in esame. In questo studio la precisione è stata analizzata sulla base dello studio di recupero. Tre diverse soluzioni a intervalli di concentrazione dell’80%, 110% e 120% della concentrazione di dosaggio calcolata sono state preparate rispettivamente per DP e RC. Le soluzioni sono state preparate aggiungendo un volume noto delle soluzioni standard (soluzioni A e B) alle rispettive soluzioni campione. I risultati hanno presentato un recupero medio del 100,28% con % RSD 0,82 per RC e 100,02% e 0,48, rispettivamente, per DP (tabella 4). Pertanto è stata stabilita una precisione apprezzabile nell’intervallo di studio.

Soluzione % del valore nominale per RC Concentrazione della soluzione finale in µg-mL-1 Recupero % Concentrazione osservata di soluzione finale (µg-mL-1) Valore medio del saggio (mg-100 mL-1) Recupero osservato % Precisione % % RSD 100 40.00 – 40.33 50.42 – – 0.20 RA 80 32.00 80.00 32.27 40.35 80.03 100.03 RB 110 44.03 110.07 44.93 56.17 111.40 101.21 0.82 RC 120 48.12 120.30 48.33 60.42 119.83 99.61 Soluzione % del valore nominale per DP Concentrazione della soluzione finale in µg-mL-1 Recupero % Concentrazione osservata di soluzione finale (µg-mL-1) Valore medio del saggio (mg-100 mL-1) Recupero osservato % Precisione % % RSD 100 40.00 – 39.82 49.77 – – 0.02 DA 80 32.00 80.00 31.88 39.84 79.91 99.89 DB 110 44.12 110.30 44.05 55.09 110.69 100.35 0.48 DC 120 47.99 119.97 47.69 59.61 119.77 99.83

Nota: media da tre iniezioni replicate da preparazioni campione. Lo studio di recupero è effettuato su tre range di concentrazione.

Tabella 4

Risultati dello studio di accuratezza.

3.1.4. Precessione

Nel nostro studio la precessione è stata stabilita sulla base della deviazione standard o della deviazione standard relativa di una serie di misure come la ripetibilità e la precessione intermedia della tecnica sviluppata. Per lo studio di ripetibilità sei soluzioni campione al 100% della concentrazione di prova sono state preparate separatamente e analizzate utilizzando la procedura analitica in studio. La stessa soluzione campione è stata iniettata in triplicato per tre giorni consecutivi e il risultato così ottenuto è stato utilizzato per determinare la precessione intermedia. La precessione infragiornaliera ha presentato un valore % RSD di 0,19 e quella infragiornaliera variava da 0,19% a 0,21% solo per RC e 0,20 e da 0,11 a 0,19 per DP rendendo la procedura analitica precisa sotto l’intervallo di studio (Tabella 2).

3.1.5. Specificità

La valutazione inequivocabile dell’analita in esame da una miscela di componenti come impurità, prodotti di degradazione e componenti della matrice è stata definita specificità. In questo studio la specificità di DP e RC è stata determinata sulla base dello studio cromatografico della purezza dei picchi delle soluzioni campione. Un picco è stato considerato spettralmente omogeneo, cioè privo di coeluizione, solo quando l’angolo di purezza del picco era inferiore alla soglia. Lo studio ha presentato l’angolo di purezza del picco per RC e DP 0,129 e 0,217, rispettivamente, e la soglia di purezza del picco 0,337 e 0,411, rispettivamente (Tabella 3). Pertanto si è concluso che i rispettivi picchi erano spettralmente omogenei, privi di impurità coelutanti e specifici per l’analisi simultanea di RC e DP.

3.1.6. Robustezza

La robustezza è stata solitamente definita come la capacità di una procedura analitica di rimanere inalterata all’introduzione di piccole ma deliberate variazioni dei parametri procedurali elencati nella documentazione della procedura e presentare un’indicazione della sua stabilità durante le analisi regolari. La robustezza del metodo attuale è stata studiata sulla base di variazioni dell’analista, degli strumenti e della stabilità della soluzione e su diverse condizioni di conservazione. I risultati sono stati trovati entro i limiti di tolleranza (tabella 5).

Saggio (mg/100 mL) Analisti Strumenti Condizioni di conservazione 1 2 3 I II III 20°C 30°C 45°C RC 50.42 50.41 50.40 50.44 50.41 50.42 50.42 50.42 50.40 50.40 DP 49.77 49.77 49.78 49.76 49.79 49.78 49.77 49.77 49.76 49.77

Tre replicati ciascuno.

Tabella 5

Studio di resistenza.

Il metodo attuale è stato trovato robusto per la quantificazione simultanea di RC e DP (Tabella 5) a concentrazioni basse come 6,64 μg-mL-1 per RC e 1. 89 μg-mL-1 per DP.89 μg-mL-1 per DP (Tabella 2).

4. Conclusione

La tecnica cromatografica liquida ad alta prestazione in fase inversa sviluppata nello studio attuale è stata semplice in termini di preparazione e analisi del campione, sensibile e selettiva per la quantificazione di resorcinolo e dexpantenolo contemporaneamente, e precisa e accurata per la loro quantificazione simultanea da una matrice complessa. Il metodo è stato convalidato in termini di accuratezza, precessione, linearità e sensibilità secondo le linee guida ICH Q2(R1). Il rispettivo tempo di ritenzione per DP e RC era di 3,19 minuti e 7,2 minuti. I picchi erano ben risolti l’uno dall’altro e da altri picchi strettamente eluenti. Così il metodo attuale è adatto per l’analisi di routine, test di stabilità e quantificazione simultanea di RC e DP da varie formulazioni disponibili sul mercato.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che non c’è conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo articolo.

Riconoscimenti

Gli autori riconoscono tutti i membri della sezione R&D per la loro gentile cooperazione e supporto. Gli autori ringraziano anche la direzione e i membri del consiglio per il loro inestimabile supporto e incoraggiamento.