I promotori controllano il legame della RNA polimerasi e dei fattori di trascrizione. Poiché la regione del promotore guida la trascrizione di un gene bersaglio, determina quindi la tempistica dell’espressione genica e definisce in gran parte la quantità di proteina ricombinante che sarà prodotta. Molti promotori comuni, come i promotori di CMV, EF1A e SV40, sono sempre attivi e quindi vengono chiamati promotori costitutivi. Altri sono attivi solo in circostanze specifiche. In questo post, parleremo dei promotori inducibili, che possono essere commutati da uno stato OFF a uno ON, e come potresti usarli nella tua ricerca. Quando hai finito con questo post, controlla il nostro post successivo sui promotori repressivi.

Come sono regolati i promotori inducibili?

I promotori inducibili possono essere regolati dal controllo positivo o negativo.

Inducibile positivo

Nello stato OFF, il promotore è inattivo perché la proteina attivatrice non può legarsi. Dopo che un induttore si lega alla proteina attivatrice, la proteina attivatrice può legarsi al promotore, accendendolo e iniziando la trascrizione.

Inducibile negativo

Nello stato OFF, il promotore è inattivo perché una proteina repressore legata impedisce attivamente la trascrizione. Una volta che un induttore lega la proteina repressore, quest’ultima viene rimossa dal DNA. Con la proteina repressore assente, la trascrizione è attivata.

Tipi di promotori inducibili

Agenti chimici, temperatura e luce sono tutti esempi di fattori che possono portare all’induzione di un promotore. Di seguito, troverete una breve descrizione di questi tre tipi di promotori inducibili, ed esempi di ogni tipo. Molti di questi sistemi di promotori sono disponibili su Addgene!

Promotori inducibili chimicamente

I promotori regolati chimicamente sono tra i promotori inducibili più comuni. Il sistema positivo inducibile della tetraciclina ON (Tet-On), uno strumento versatile sviluppato per l’uso in procarioti ed eucarioti, funziona tramite attivazione diretta. In questo sistema, l’attivatore rtTA (transattivatore inverso controllato dalla tetraciclina) è normalmente inattivo e non può legare gli elementi di risposta alla tetraciclina (TRE) in un promotore. La tetraciclina e i suoi derivati servono come agenti induttori per permettere l’attivazione del promotore.

Uno dei promotori procarioti più comunemente usati è il promotore negativo inducibile pLac. Questo promotore richiede la rimozione del repressore lac (proteina lacI) per attivare la trascrizione. In presenza di lattosio o dell’analogo del lattosio IPTG, il repressore lac subisce un cambiamento conformazionale che lo rimuove dai siti lacO all’interno del promotore e cessa la repressione del gene target. Un sistema semplificato di lac inducibile si trova in molti vettori di espressione batterica.

Il promotore inducibile negativo pBad è un altro popolare promotore procariotico spesso usato per la purificazione delle proteine batteriche. Quando l’arabinosio è assente, la proteina regolatrice AraC lega i siti O e I1 a monte di pBad, bloccando la trascrizione. L’aggiunta di arabinosio fa sì che AraC leghi i siti I1 e I2, permettendo l’inizio della trascrizione. Oltre all’arabinosio, anche il cAMP complessato con la proteina attivatrice cAMP (CAP) può stimolare il legame di AraC ai siti I1 e I2. Integrare i mezzi di crescita cellulare con il glucosio diminuisce il cAMP e reprime pBad, diminuendo la leakiness del promotore.

Altri esempi di promotori indotti chimicamente includono i promotori regolati da alcol e steroidi inducibili positivi comunemente usati nella ricerca sulle piante.

Sottotipo di promotore	Esempio di promotore	Attivatore	Addgene Plasmid/Kit
Alcool-regolato	Promotore AlcA	AlcR	pGGA008 (AlcA) e pGGC011 (AlcR) dal kit GreenGate fiamma rossa
Steroide-regolato	Promotore LexA	XVE (sintetico)	pFZ19 (fiamma gialla)

Promotori inducibili alla temperatura

I sistemi di espressione sensibili alla temperatura sono in genere meno leaky dei promotori indotti chimicamente; mostrano un’espressione vicina allo zero a temperature regolari, ma possono essere indotti dall’esposizione al calore o al freddo. Gli esempi includono i promotori Hsp70 o Hsp90 derivati da shock termico, in cui un gene di scelta è espresso solo dopo l’esposizione a un breve shock termico. Nel caso di Hsp70, lo shock termico rilascia il fattore 1 di shock termico (HSF-1), che successivamente si lega agli elementi di shock termico nel promotore, attivando così la trascrizione. I depositanti di Addgene hanno sviluppato Cre e Cas9 inducibili allo shock termico per una facile ingegneria del genoma in specie come C. elegans e Drosophila.

Promotori inducibili dalla luce

La luce è un altro modo per attivare l’espressione genica, e i sistemi a due componenti usati in biologia sintetica usano la luce per regolare la trascrizione. Il plasmide pDawn della fiamma rossa contiene la proteina YFI che rileva la luce blu. Quando la luce è assente, YFI fosforila FixJ, che si lega al promotore FixK2 per indurre la trascrizione del fago repressore cI. Il repressore cI inibisce la trascrizione dal promotore fagico pR, impedendo l’espressione di un gene reporter. Quando la luce è presente, YFI è inattivo, impedendo la sintesi del repressore cI e permettendo la trascrizione del gene reporter. Addgene ha anche sistemi a due componenti regolati dalla luce della fiamma gialla progettati dal laboratorio Tabor.

Quale promotore inducibile è giusto per me?

Ecco una lista di alcune importanti variabili da considerare quando si sceglie un promotore inducibile.

Sistema sperimentale

Perché il meccanismo di trascrizione differisce tra tipi di cellule o organismi, i promotori sono altrettanto variabili. I promotori batterici funzionano solo in cellule procariotiche e tipicamente solo nella stessa specie o in specie strettamente correlate da cui sono stati derivati. Allo stesso modo, i vari tipi di cellule eucariotiche (mammiferi, lievito, piante, ecc.) richiedono promotori unici e c’è pochissimo crossover. Il meccanismo di induzione deve anche essere compatibile con il tuo sistema sperimentale.

Leakiness

Se stai esprimendo un gene che può essere tossico, è importante che il tuo promotore inducibile non sia troppo leaky. Per i promotori procariotici inducibili, pLac è noto per essere leggermente leaky, e pBad è probabilmente un’opzione migliore poiché l’espressione può essere repressa dal glucosio. I promotori inducibili in temperatura sono anche noti per la loro bassa perdita.

Livello di inducibilità

Quanto vuoi indurre la trascrizione del tuo gene target? La forza dei promotori inducibili può variare molto. Se stai cercando un’alta inducibilità, il sistema Tet-On può essere una buona scelta, dato che è documentato per indurre la trascrizione >1.000 volte quando attivato.

Tempo di ritardo

Il tempo necessario per indurre un dato promotore varia. I promotori che richiedono solo l’aggiunta di un induttore esterno, come i sistemi Tet, possono essere attivati molto rapidamente. Al contrario, i sistemi di promotori che richiedono la trascrizione di un repressore/induttore avranno un ritardo maggiore a causa del tempo necessario per la trascrizione/traslazione.

Molti ringraziamenti a Nicole Zurcher che ha contribuito alla scrittura di questo articolo.

Risorse aggiuntive sul blog di Addgene:

• Plasmidi 101: La regione promotrice
• Plasmidi 101: Cre-lox
• Sistemi a due componenti commutabili alla luce per E. coli
• Sfoglia altri post del blog dalla nostra serie Plasmidi 101