TEXT

A Yersinia pestis a pestis etiológiai kórokozója, és biológiai fegyverként is felhasználható (1, 13, 17-20, 23). Emiatt fontos, hogy a kialakuló gyógyszerrezisztencia, legyen az természetes vagy mesterséges, több laboratóriumban könnyen alkalmazható, szabványosított módszerekkel kimutatható legyen. A Klinikai és Laboratóriumi Szabványügyi Intézet (CLSI) leírja a Y. pestis antimikrobiális érzékenységének vizsgálatára szolgáló referenciamódszert (BMD), és nyolc antimikrobiális szerre vonatkozóan MIC értelmezési útmutatót ad (6). A BMD kationokkal korrigált Müller-Hinton-lombikot (CAMHB) használ, és 35 °C-on 24 órán át történő inkubálást igényel, amelyhez 48 órás inkubációra is van lehetőség, ha a 24 órás növekedés nem elegendő a végpontok értelmezéséhez. Sajnos a referencia BMD-t sok laboratóriumban nehéz alkalmazni, mivel viszonylag költséges és munkaigényes, és a paneleket fagyasztott vagy dehidratált formában kell tárolni. Számos alternatív érzékenységvizsgálati módszer létezik, köztük a korongdiffúziós és az Etest módszer. Mielőtt azonban ezeket a módszereket egy faj esetében alkalmazni lehetne, értékelni kell őket, és össze kell hasonlítani a BMD-vel, hogy meghatározzák a módszerek összehasonlításával kapott eredmények közötti összefüggéseket.

A Y. pestis izolátumok igényesek és lassabban növekedhetnek mesterséges táptalajon, mint az Enterobacteriaceae más gyakori fajai, ezért a Y. pestis érzékenységvizsgálati módszereit nehéz volt standardizálni. Az irodalomban több módszert is leírtak. A korongdiffúziós vizsgálatot általában Mueller-Hinton-agaron (MHA) végezték, jellemzően 48 órás, 35 °C-on történő inkubációval, de a módszertani leírások néha nem elég részletesek (10, 16, 24). Az Etest-módszert Wong és munkatársai (25) alkalmazták 5% juhvérrel kevert MHA-t, 35°C-on történő inkubációt és olyan inokulumot használva, amely megfelel egy sz. 1 McFarland-szabványnak felel meg a legtöbb korong- vagy Etest-diffúziós vizsgálatban használt 0,5 McFarland-szabvány helyett. Az irodalomban a 27-30 °C-on 48 órán át inkubált MHA-t használó agar-hígítás a leggyakoribb módszer (7, 8, 11, 12, 22). A tésztamakrodilúciós és mikrodilúciós módszereket is alkalmazták különböző inkubációs hőmérsékletekkel (2, 21).

A korongdiffúziós és Etest módszereknek számos olyan tulajdonsága van, amely vonzó alternatív módszerré teszi őket a fogékonysági vizsgálatokhoz, beleértve a könnyű tárolhatóságot és a korongok és csíkok hosszú eltarthatósági idejét. Emellett ezek agar alapú módszerek, és a végpontok könnyebben leolvashatók, mint a BMD esetében. Az Etest további előnye, hogy MIC-eredményt ad. Ebben a jelentésben egy multicentrikus vizsgálat eredményeit mutatjuk be, amelyben az Etest és a korongdiffúziós módszereket a CLSI referencia BMD módszerrel hasonlítjuk össze a Y. pestis fogékonysági vizsgálatára.

(Ez a jelentés részben az American Society for Microbiology 107. közgyűlésén került bemutatásra, Toronto, Kanada, 2007. május 21-25. között.)

A Centers for Disease Control and Prevention (CDC) és az U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) gyűjteményeiből származó 26 különböző Y. pestis törzset vizsgáltak mind az Etest, mind a BMD módszerrel négy vizsgálati helyen, és ezen kívül lemezdiffúzióval két helyen. Hat törzs az Antiqua biovar, hét a Medievalis biovar és 12 az Orientalis biovar volt; egy atipikus izolátumot nem lehetett egyik biovarba sem besorolni. Az antimikrobiális szereket mind a BMD-vel, mind az Etesttel (bioMérieux, Durham, NC) vizsgálták, és a megfelelő tartományok a következők voltak a BMD és az Etest esetében: klóramfenikol esetében 0,03-64 μg/ml és 0,016-256 μg/ml; ciprofloxacin esetében 0,03-64 μg/ml és 0,002-32 μg/ml; doxiciklin esetében 0,03-64 μg/ml és 0.016-256 μg/ml; gentamicin esetében 0,03-64 μg/ml és 0,016-256 μg/ml; levofloxacin esetében 0,06-64 μg/ml és 0,002-32 μg/ml; streptomicin esetében 0,03-64 μg/ml és 0,002-32 μg/ml; sztreptomicin esetében 0,03-64 μg/ml és 0.016-256 μg/ml; tetraciklin esetében 0,03-64 μg/ml és 0,016-256 μg/ml; és trimetoprim-szulfametoxazol esetében 0,015/32-16/304 μg/ml és 0,002/0,038-32/608 μg/ml. Mivel egyes gyógyszerek BMD-vizsgálatának tartományai nem foglalták magukban az Etest által elérhető alacsonyabb koncentrációkat, a módszerek közötti lényeges egyezést (± 1 log2 hígítás) néhány eredmény összehasonlításánál a skálán kívülinek tekintették (pl. a BMD levofloxacin MIC értéke ≤0,06 μg/ml és az Etest MIC értéke 0,03 μg/ml). A CDC-ben 96 lyukú MIC-tálcákat készítettek, lyukanként 100 μl CAMHB (BBL, Sparks, MD) felhasználásával; a tálcákat -70°C-on fagyasztva tartották és szállították a részt vevő laboratóriumokba. A vizsgálatokat a CLSI szabványos BMD- és korongdiffúziós módszereivel végezték (4-6). Az inokulákat 5%-os juhvér-agar lemezeken (BBL) termesztett 18-24 órás aerob kultúrákból állították elő a közvetlen kolóniaszuszpenziós módszerrel Mueller-Hinton-lében (MHB) (Remel, Lenexa, KS), hogy a 0,5 McFarland-turbiditási standardnak (4) megfeleljenek; ugyanezeket az inokulákat használták a 150 mm átmérőjű MHA lemezek beoltására az Etest és a korongdiffúziós vizsgálatokhoz. Közvetlenül a beoltás után minden vizsgálati helyen legalább két véletlenszerű kolóniaszámlálást végeztünk a pozitív BMD növekedési kontrollkúttal, hogy felmérjük az inokulum méretét. Egy lemezre legfeljebb négy Etest-csíkot helyeztek. A lemezdiffúzióhoz a kereskedelmi forgalomban kapható lemezeket (BBL) öntapadós többlemezes adagolóval (BBL) alkalmaztuk. A BMD-paneleket és az Etest- és lemezdiffúziós MHA-lemezeket egyaránt 35 °C-on inkubáltuk, és 24 és 48 órás időközönként leolvastuk. Az Etestek leolvasása az Etest betegtájékoztatójának megfelelően történt az alábbiak szerint: a klóramfenikolt, doxiciklin, tetraciklin és trimetoprim-szulfametoxazol 80%-os gátlásnál olvastuk le a metszéspontnál; a ciprofloxacint, levofloxacint, gentamicint és streptomicint 100%-os gátlásnál olvastuk le. Az adatelemzésekhez az Etest MIC-értékeket a legközelebbi log2 hígításra kerekítettük fel. Az Escherichia coli ATCC 25922-t és a Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-at használtuk a BMD és az Etest minőségellenőrzéséhez. A minőségellenőrzési törzsek MIC-értékeit 16-20 órás inkubációval határozták meg. A sztreptomicin elfogadható BMD minőségellenőrzési tartományait korábban a CDC-ben állapították meg (nem publikált adatok). A klóramfenikol Etest minőségellenőrzését Escherichia coli ATCC 25922 vizsgálatával és a CLSI BMD elfogadható tartományának alkalmazásával végeztük.

Az Etest és a BMD eredményei közötti egyezés mérésére megvizsgáltuk a log2 hígítású MIC-értékek közötti különbségek eloszlását, és minden egyes hatóanyag esetében kiszámítottuk az azonos értékeket adó MIC-meghatározások százalékos arányát (a referencia-módszer pontossági határán belüli lényeges egyezés). Annak megállapítására is, hogy az Etest módszer szignifikánsan alacsonyabb vagy magasabb MIC-értékeket eredményezett-e, mint a referenciamódszer, Wilcoxon előjeles-rang tesztet végeztünk a két teszt log2 hígítású MIC-értékeivel a SAS statisztikai szoftver (SAS Institute Inc., Cary, NC) segítségével; a ± 1 log2 hígításon belüli MIC-értékeket ennél a tesztnél azonosnak tekintettük. Az értelmezési kategóriák (fogékony, közepes és rezisztens) eredményeinek összehasonlítása a kisebb, nagyobb és nagyon nagy hibák arányának kiszámításával történt.

A MIC végpontok általában könnyebben megkülönböztethetők voltak a BMD-vel, mint az Etesttel 24 órán belül (az adatok nem láthatóak). Három vizsgálati helyen (A, B és C) majdnem minden BMD és Etest MIC-érték leolvasható volt az inkubáció 24 órájában; egyetlen Etest eredmény volt a kivétel. A D helyszín egy törzs kivételével minden törzs esetében leolvasható BMD MIC-értékeket jelentett 24 órán belül. A D helyszínen nyolc törzs esetében nem volt elegendő növekedés a 24 órás Etest MIC-értékek leolvasásához. A 24 órás növekedés elégtelensége miatt ki nem olvasható Etest MIC-értékek száma hatóanyagonként a következő volt: klóramfenikol, n = 6; ciprofloxacin, n = 4; doxiciklin, n = 3; gentamicin, n = 2; levofloxacin, n = 5; streptomicin, n = 5; tetraciklin, n = 4; és trimetoprim-szulfametoxazol, n=4. Minden vizsgálóhelyen minden eredményt 48 órán belül le tudtak olvasni, ezért az összehasonlítás során a 48 órás eredményeket használták. A kolóniaszámlálás azt mutatta, hogy a BMD kutakban a beoltási sűrűség mind a négy vizsgálati helyszínen elfogadható határértékeken belül volt; a helyszínek átlaga 1,1 × 105 CFU/ml és 4,2 × 105 CFU/ml között mozgott.

A MIC90 és a MIC-tartományt az egyes antimikrobiális szerek esetében módszerenként hasonlították össze (1. táblázat). A klóramfenikol kivételével minden hatóanyag esetében a MIC90-ek minden módszer esetében megegyeztek, vagy ± 1 log2 hígításon belül voltak. Az Etest és a BMD módszerek közötti kategóriaegyezés minden gyógyszer esetében kiváló volt, 97% és 100% között; minden hiba kisebb volt (1. táblázat). Minden BMD és Etest MIC-érték 24 órás inkubáció után a fogékony tartományon belül volt (az adatok nem láthatóak). 48 óra elteltével a legtöbb MIC-érték a fogékony tartományon belül volt, kivéve a következő nem fogékony eredményeket: klóramfenikol (n = 2); ciprofloxacin (n = 1); és streptomicin (n = 5). A legtöbb nem érzékeny eredmény nem az Etest, hanem a BMD módszerből származott (1. ábra).

A két módszer összehasonlítása legjobban az alapvető egyezés elemzésével lehetséges (a két módszer esetében a ± 1 log2 hígításon belüli MIC-értékek százalékos aránya ). Az esszenciális egyezés az összes helyszínre együttesen (beleértve a skálán kívüli MIC-értékeket is) ≥90% volt a ciprofloxacin, doxiciklin, levofloxacin, streptomicin és tetraciklin esetében. A gentamicin, a trimetoprim-szulfametoxazol és a klóramfenikol esetében az alapvető egyezés értékei alacsonyabbak voltak, 88%, 78%, illetve 35%. A klóramfenikol és a trimetoprim-szulfametoxazol kivételével az egyes gyógyszerek esetében a helyszínek között általában nem vagy csak kis mértékben volt eltérés az alapvető egyezésben (3. táblázat). A klóramfenikol és a trimetoprim-szulfametoxazol esetében a MIC-módszerek közötti alapvető egyezés az egyes helyszíneken 4% és 81%, illetve 58% és 96% között mozgott.

A gentamicin és doxiciklin Etest MIC értékei szignifikánsan (P = 0.03) magasabbak, mint a megfelelő BMD MIC-értékek (2. táblázat); azonban a módszerek közötti alapvető egyezés értékei az egyes gyógyszerek esetében még mindig jók voltak, 88%, illetve 93% (2. táblázat). A klóramfenikol, a ciprofloxacin és a trimetoprim-szulfametoxazol Etest MIC-értékek átlagosan szignifikánsan (P < 0,001) alacsonyabbak voltak, mint a megfelelő BMD MIC-értékek, és csak a ciprofloxacin esetében volt ≥90%-os az alapvető egyezés. A levofloxacin, a streptomicin és a tetraciklin esetében nem volt statisztikai különbség az Etest és a BMD MIC-értékek között.

A korongdiffúzió esetében a streptomicin kivételével minden antimikrobiális korong nagy átmérőjű zónákat eredményezett; néhány zóna átmérője meghaladta a 40-50 mm-t (4. táblázat), és átfedték egymást az MHA-lemezen. Az ilyen nagy zónákat előidéző gyógyszerek zónaszélei gyakran homályosak vagy homályosak voltak. Az egyik vizsgálati helyszínen két izolátum esetében minden hatóanyag esetében olvashatatlan zónák voltak, mivel a növekedés 24 óra alatt gyenge volt. A klóramfenikol és a trimetoprim-szulfametoxazol lemezek esetenként kettős zónahatást eredményeztek, világosabb belső növekedési peremmel, ami valószínűleg a hatóanyag statikus aktivitásának köszönhető ezzel a lassan növekvő organizmussal szemben. A sztreptomicinkorongok produkálták a legalacsonyabb (23-24 mm átmérőjű) átlagos korongzóna-gátlási méretet és a legegyértelműbb, leolvasható zónákat. A többi korongtípus zónamérete 48 óra elteltével átlagosan 30-42 mm átmérőjű volt, és átmérőjük nehezebben volt leolvasható.

Az Etest módszer és az antimikrobiális érzékenység vizsgálatára szolgáló referencia BMD módszer között általában jó volt az alapvető egyezés. Az Etest és a BMD közötti esszenciális egyezés aránya azonban a klóramfenikol, a gentamicin és a trimetoprim-szulfametoxazol esetében alacsonyabb volt, mint az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatala (FDA) által az új módszer klinikai vizsgálatokban való alkalmazására ajánlott 90%-os minimum (http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm071462.pdf).

A biológiai biztonsági szekrényben az egyes vizsgálati helyszíneken a világítás intenzitásának különbségei hozzájárulhatnak a végpont meghatározásához. Azt tapasztaltuk, hogy az Etest végpont leolvasása könnyebb, ha egy olvasólámpát helyezünk el a szekrényben a fényforrás kiegészítéseként. A D helyszín kivételével valamennyi helyszín használta ezt a kiegészítő fényforrást a fogékonysági tesztek leolvashatóságának javítása érdekében. A tetraciklin és doxiciklin Etesteket, a klóramfenikolhoz és a trimetoprim-szulfametoxazolhoz hasonlóan, szintén 80%-os végponttal olvasták le, de kettős ellipszisek nem voltak észlelhetők, és az alapvető egyezés ≥90% volt mindkét tetraciklin-osztályba tartozó gyógyszer esetében, így úgy tűnik, hogy ez az Etest-jelenség gyógyszerosztályonként változik a Y. pestis esetében.

A gentamicin esetében az általános alapvető egyezés 88% volt, éppen az ajánlott 90%-os egyezés határértéke alatt. Két helyen magas (96%-os) esszenciális egyezést mutattak ki, de a másik két helyen az egyezés alacsonyabb volt (77% és 81%). Ennek az eltérésnek az oka nem ismert. Az Etest és a BMD MIC-értékek általános MIC-eloszlása azonban hasonló (1. ábra). Azt javasolták, hogy a lassan növekvő vagy igényes organizmusokkal végzett új érzékenységi módszerek esetében a vizsgálatokat kevésbé szigorúan kellene ehhez a standardhoz kötni, és megengedhető az alacsonyabb esszenciális egyezés (14). Ez a logika megfelelőnek tűnik a gentamicin Etest esetében, mivel az alapvető egyezés 88%-os volt. A trimetoprim-szulfametoxazol E-teszt elfogadhatósága 78%-os esszenciális egyezés mellett nem egyértelmű.

A vizsgálat korlátja az volt, hogy nem vontak be ismert rezisztenciájú izolátumokat. A madagaszkári gyógyszerrezisztens törzsekhez (3, 9-11) korlátozott a hozzáférés. A Y. pestis gyógyszerrezisztenciájáról szóló egyéb jelentések ritkák, és a rezisztens törzsek nem jól jellemzettek (15, 16, 24). Ezért nem tudtuk értékelni az Etest módszer képességét a Y. pestis ismert rezisztenciájának kimutatására.

A korongdiffúziós módszer nem ajánlott a Y. pestis esetében, mivel a legtöbb vizsgált gyógyszer esetében nehéz leolvasni a rosszul definiált gátlási zónákat és a nagy zónaátmérőket. A sztreptomicinkorongos vizsgálat további vizsgálatot igényelhet, ha a sztreptomicin-rezisztens izolátumok hozzáférhetővé válnak, mivel a zónaméretek kisebbek és jobban elkülönülőek voltak, mint a többi koronggal kapott zónák.

Összefoglalva, a Y. pestis fogékonysági vizsgálatára szolgáló két MIC-módszer összehasonlítása során az Etest és a BMD eredményei valamennyi antimikrobiális szer esetében jól korreláltak, kivéve a klóramfenikolt és a trimetoprim-szulfametoxazolt, amelyek esetében a végpontokat az Etest segítségével nehéz volt meghatározni. A klóramfenikol és a trimetoprim-szulfametoxazol esetében nagyobb volt a helyenkénti eltérés, mint a többi gyógyszer esetében. Az Etest módszer a ciprofloxacin, doxiciklin, gentamicin, levofloxacin, streptomicin és tetraciklin esetében a BMD elfogadható alternatívájának tűnik, a klóramfenikol és a trimetoprim-szulfametoxazol esetében azonban nem. Mivel a Y. pestis lassan növekedett az MHA-n, az Etesthez 48 órás inkubáció ajánlott. Mivel azonban vizsgálatunkban nem tudtunk gyógyszerrezisztens Y. pestis törzseket bevonni, a nem érzékeny Etest MIC-értékek megerősítése is ajánlott egy referencia BMD MIC-teszttel. Azt is javasoljuk, hogy minden olyan Y. pestis izolátumon, amelynek ciprofloxacin vagy levofloxacin Etest MIC értéke 0,25 μg/ml, azaz a fogékony tartomány felső határán lévő MIC értéke, megerősítő BMD vizsgálatot végezzenek, mivel nem ismert, hogy az Etest módszerrel kimutatható-e a kialakuló rezisztencia e két gyógyszer esetében.