- Abstract
- Bevezetés
- Egerek csíravonalának mutagenizálása
- Betegségmodellek izolálása az ENU segítségével
- Nagyszabású szűrők
- Kisléptékű szűrések
- Génvezérelt és fenotípusvezérelt megközelítések kombinálása
- Pontmutációk azonosítása
- Betegségfenotípusok szűrése
- Mutáns egerek erőforrásainak létrehozása
- Genetikai erőforrások
- Archiválás
- Adatbázisok
- Disztribúció
- A jövő fényesnek tűnik
- Köszönet
Abstract
A humán genom szekvenálásának fejlődése a génfunkció meghatározására irányuló genetikai megközelítéseket ösztönzi. Az olyan stratégiák, mint a géncsapdák és a kémiai mutagenezis, hamarosan nagy mutáns egér erőforrást fognak létrehozni. Az N -etil-N -nitrozourea (ENU) által indukált pontmutációk egyedülálló mutáns erőforrást jelentenek, mivel: (i) a pozícióhatásoktól függetlenül tükrözik az egyes génváltozások következményeit; (ii) a fehérjefunkció finom szerkezetű boncolását teszik lehetővé; (iii) a mutánsok hatásai a teljes vagy részleges funkcióvesztéstől az eltúlzott funkcióig terjednek; és (iv) elfogulatlan módon fedezik fel a génfunkciókat. Az egéren végzett fenotípus-alapú ENU-szűrések a kardiológia, fiziológia, neurológia, immunitás, vérképzés és emlősök fejlődése révén a humán klinikai betegségek szempontjából is fontosak. Az ilyen megközelítések rendkívül hatékonyak az összetett emberi betegségek és tulajdonságok megértésében: a bázispár-változások pontosan modellezhetik az emberi betegségekben előforduló bázisváltozásokat, és a standard genetikai háttérben lévő finom mutáns allélok lehetővé teszik az összetett genotípusok következményeinek elemzését. A folyamatban lévő egér ENU mutagenezis kísérletek új mutációk kincsesbányáját hozzák létre, amelyek lehetővé teszik egyetlen gén, egy kromoszómarégió vagy egy biológiai rendszer alapos vizsgálatát.
Bevezetés
A manipulatív genetikai eszközök az egérben kiterjedtek és hatékonyak. Az egérgenetikusok kiiktathatnak vagy túlterjeszthetnek géneket az egész állatban vagy egy adott szövetben, nagy saját vagy idegen DNS-darabokat vihetnek be a genomba, és egész kromoszómákat módosíthatnak. Ezek a technikák, valamint az egér és az ember közötti genetikai, fejlődési, patológiai és fiziológiai hasonlóságok a laboratóriumi egeret az emberi betegségek kutatásának elsődleges modellszervezetévé tették. A beltenyésztett egértörzsek lehetőséget nyújtanak arra, hogy egy betegségtulajdonságot meghatározott genetikai háttérrel tanulmányozzunk, lehetővé téve az egyetlen mutáció által okozott fenotípusok és más genetikai módosítók hozzájárulása közötti különbséget.
Az a képesség, hogy homológ rekombinációval, embrionális őssejtekben funkcióvesztéses mutációkat tudtunk létrehozni, forradalmi változást hozott az egérbiológiában. Az embrionális őssejt-technológia segítségével az emberi betegségben szerepet játszó bármely gén megzavarható, értékes információkat szolgáltatva a mutáció következményeiről az egész állatban. Míg a nullmutációk szükségesek, az N -etil-N -nitrozourea (ENU) által kiváltott finom mutációk felbecsülhetetlen értékűek a génműködés teljes spektrumának vizsgálatához. A kódoló régiókban és a szabályozó elemekben bekövetkező mutációk nagyon eltérő fenotípusokat eredményezhetnek, miközben a fehérjefunkció és a génszabályozás finomszerkezeti tagolását teszik lehetővé. Az allélsorozatok homológ rekombinációval is létrehozhatók, de a fenotípusvezérelt mutagenezis számos előnyt kínál a generálás gyorsasága és a kutatói torzítás kiküszöbölése tekintetében. Ezért az egérgenom knockout-adatbázisát csak kiindulópontnak kell tekinteni; a funkcionális elemzés befejezéséhez további allélok és szövetspecifikumok kötelezőek.
Egerek csíravonalának mutagenizálása
Az ENU etilcsoportját oxigén- vagy nitrogéngyököknek adhatja át a DNS-ben, ami hibás párosodást és bázispár-helyettesítést eredményez, ha nem javul. A legnagyobb mutációs ráták a premeiotikus spermatogonialis őssejtekben fordulnak elő, ahol az egyes lókuszok mutációs gyakorisága 6-1,5 × 10 -3 ( 1-3 ), ami azt jelenti, hogy minden 175-655 átvizsgált ivarsejtből egy esetben mutációt kapunk egy kiválasztott génben. Az ENU-t, mivel képes izolálni a mutációkat bármely génben vagy az érdeklődésre számot tartó régióban, egérben a következő célokra használták: (i) egyetlen gén multiallélikus sorozatának megszerzésére a funkció további meghatározása céljából; ii) biokémiai vagy fejlődési útvonalak feltárására; iii) új recesszív mutációk megszerzésére egyetlen kromoszómán vagy az egész genomban; és iv) az egérgenom deléciókkal feltárt régióinak telítésére ( 4-10 ). A 24 génből származó 62 szekvenált csíravonal-mutáció elemzése azt mutatja, hogy az ENU túlnyomórészt A/T bázispárokat módosít, 44%-ban A/T→T/A transzverzió, 38%-ban A/T→G/C átmenet, 8%-ban G/C →A/T átmenet, 3%-ban G/C→C/G transzverzió, 5%-ban A/T→C/G átmenet és 2%-ban G/C→T/A átmenet ( 1. táblázat ; 1. ábra ). Fehérjetermékké fordítva ezek a változások 64%-ban missense mutációkat, 10%-ban nonsense mutációkat és 26%-ban splicing hibákat eredményeznek ( 1. táblázat ; 1. ábra ).
Mivel pontmutagén, az ENU számos különböző típusú allélt indukálhat. Funkcióvesztéses mutációkat, letális komplementációs csoportok életképes hipomorfiumait, antimorfiumokat és gain-of-function mutációkat izoláltak egérmutagenezis-szűrések során ( 4 , 9-16 ). Az egyetlen lokuszon található allélsorozatok rendkívül erősek, ha együttesen elemzik őket a funkció meghatározásához. Az összetett lókuszokon található allélsorozatok megzavarhatják az egyes fehérjeizoformákat, ami a különböző szövetekben a szervezet élete során különböző funkciók felfedezéséhez vezet ( 17 ). Az ilyen allélsorozatra szembetűnő példa a quaking ( qk ) lókusz. Az ENU-indukált allélok izolálása előtt a quaking lókuszt egyetlen spontán allél, a qkV határozta meg, amelynek homozigóta fenotípusa a súlyos központi idegrendszeri (CNS) dysmyelinizáció okozta rohamok és quaking volt ( 18 ). Az ENU-indukált allélok azonban azt mutatják, hogy a quaking az embriogenezis során is működik ( 7 , 13 ). Az öt ENU-indukált allél közül négy ( qk1-1 , qkkt1 , qkkt2 , qkkt3/4 ) homozigótája 8,5-10,5 embrionális napon (E) elhalálozik CNS-hibákkal, míg csak az egyik (qke5 ) életképes kvaterkázással és rohamokkal (19; J.K. Noveroske és M.J. Justice, publikálatlan adatok). Bár a quaking allélok csoportosíthatók az embrió letalitása vagy az életképes dysmyelinizáció alapján, mindegyik allél valamilyen jelentős módon eltér ezektől az általános fenotípusoktól, ami egyedülálló és értékes erőforrássá teszi őket a finomszerkezet/funkció vizsgálatokhoz és a humán neurális csőhibák, valamint a görcsrohamok és myelinizációs rendellenességek modellezéséhez ( 2. táblázat ). Az ENU-val vagy más komplex lókuszokon történő géncélzással létrehozott allélsorozatok értékes eszközök lesznek a fehérjefunkció feltárásához ( 17 ).
A szekvenált ENU-indukált mutációk összefoglalása
A szekvenált ENU-indukált mutációk összefoglalása
.indukált mutációk
ENU-mutagenezis a mutációk izolálásához. Az ENU az egér spermatogoniális őssejtek DNS-ében károsodásokat idéz elő, amelyek elsősorban az AT bázispárokat érintik. Ezek az elváltozások jelen vannak a hím spermiumában, és genetikai és fenotípusos szűrésekkel történő izolálásuk után különféle fenotípusos mutációkat eredményeznek. A mutáns fehérjetermékek elsősorban miszense-mutációk, a mutációk értékes osztálya a fehérjék szerkezetének és funkciójának boncolásához. Az egérben végzett mutagenezis a humán betegségek modellezésére helyezi a hangsúlyt fenotípus-vezérelt vizsgálatokon keresztül.
ENU mutagenezis a mutációk izolálására. Az ENU az egér spermatogoniális őssejtek DNS-ében károsodásokat idéz elő, amelyek elsősorban az AT bázispárokat érintik. Ezek az elváltozások jelen vannak a hím spermiumában, és genetikai és fenotípusos szűrésekkel történő izolálásuk után különféle fenotípusos mutációkat eredményeznek. A mutáns fehérjetermékek elsősorban miszense-mutációk, a mutációk értékes osztálya a fehérjék szerkezetének és funkciójának boncolásához. Az egérben végzett mutagenezis a humán betegségek fenotípus-vezérelt vizsgálatokon keresztül történő modellezésére helyezi a hangsúlyt.
Betegségmodellek izolálása az ENU segítségével
Az ENU által kiváltott mutációk izolálására különböző genetikai szűrések használhatók. Egyetlen generációs szűréssel gyorsan életképes és termékeny mutánsokat lehet létrehozni, amelyek allélsorozatokat, módosítókat vagy domináns mutációkat képviselnek. A kétgenerációs deléciós szűrőkkel a genom egy meghatározott régiójában recesszív letális mutációkat lehet azonosítani. Háromgenerációs törzskönyvi szűrőkkel a teljes genomot átvizsgálhatjuk az érdeklődésre számot tartó életképes mutáció után, vagy – kapcsolt markerekkel vagy kiegyensúlyozó kromoszómákkal kombinálva – letális vagy steril allélok izolálására (lásd alább).
Nagyszabású szűrők
Nemzetközi szinten már több nagyszabású mutagenezis szűrőt is finanszíroztak. E szűrések fő jellemzőit a 3. táblázat foglalja össze. E szűrések mindegyike különböző genetikai stratégiát alkalmaz a mutációk izolálására: egyes szűrések domináns mutációkat céloznak, míg másokat recesszív mutációk izolálására terveztek. Egyes csoportok a humán genomprojekttel párhuzamosan regionális mutagenezissel vizsgálják a recesszív letális és káros mutációkat, hogy a génfunkcióval foglalkozzanak. Más csoportok nagyszámú mutagenizált genomot vizsgálnak domináns neurológiai és klinikai hematológiai vagy biokémiai variánsok után.
Kisléptékű szűrések
A mutációk szűrését nem kell nagy léptékben végezni. A kis laboratóriumok számára két költséghatékony stratégia az allélsorozatok és a szenzitizált útvonalszűrések. A szenzitizált útvonal-szűrés egyetlen biológiai vagy biokémiai útvonalat céloz meg, és kihasználja a nem-allélikus nem-komplementációt a mutációk izolálására a mutagenizált hímek első generációs utódaiban. Egy ilyen szűrés során egy olyan lókuszon indukált mutáció (*), amely kölcsönhatásba lép a keresett lokkal ( m ), nem komplementálódhat (*/+;+/ m ), mégis az eredeti homozigóta mutánsra emlékeztető fenotípust eredményezhet ( m/m ). Egyes szenzitizált szűréseket genetikai módosítás helyett gyógyszer- vagy környezeti módosítás hátterében is el lehet végezni. Például fenilalanin injekciót szenzitizátorként használva számos, a fenilalanin anyagcsere útját befolyásoló mutációt izoláltak heterozigótaként ( 20 , 21 ).
Génvezérelt és fenotípusvezérelt megközelítések kombinálása
A mutációk izolálásának egyedülálló megközelítése az embrionális őssejtekben történő génalapú célzás és a fenotípusvezérelt ENU-mutagenezis kombinációja. A Drosophilában alkalmazott hatékony genetikai stratégiák a genetikai reagensek, például a deléciók, duplikációk és inverziók elérhetőségére támaszkodnak, amelyek megkönnyítik a genetikai szűréseket és egyszerű, költséghatékony állományfenntartást biztosítanak. A deléciók hasznosak a genetikai szűrésekben a haploidia létrehozásához, valamint a nem-komplementációs stratégiákat alkalmazó térképezéshez ( 2. ábra B) ( 22 ). A domináns markert hordozó és homozigóta letális inverziók ideális egyensúlyozó kromoszómák a rekombináció elnyomására és a letális vagy káros mutációk izolálására és fenntartására alkalmas utódosztályok könnyű azonosítására ( 2. ábra C). A teljes kromoszómarégiók Cre /loxP-technológiák segítségével történő módosításának képessége lehetővé teszi e genetikai reagensek létrehozását egy kétlépéses géncélzási folyamat során ( 2. ábra A) ( 23 , 24 ). A megközelítés génalapú, mivel a deléció vagy az inverzió végpontjai ismertek, ami minimálisra csökkenti az átrendeződések jellemzéséhez szükséges erőfeszítéseket. A mérnöki technikák lehetővé teszik, hogy az átrendeződéseket egy domináns sárga szőrszínjelölővel, a K-14 agoutival jelöljük meg, ami egyszerű térképezéshez, állományfenntartáshoz és genetikai szűrésekhez nyújt erőforrást ( 22 , 24 , 25 ). A célzott eseményekhez szükséges konstrukciókat tartalmazó egérgenom-könyvtárak létrehozása gyors rendszert biztosít azok előállításához az egérgenom bármely pontján ( 2. ábra A) ( 25 ).
A kvázi allélok egyedi jellemzői
A kvázi allélok egyedi jellemzői
A finanszírozott nagy-.scale ENU screens
Funded large-scale ENU screens
An initial mutagenesis effort, amelynek célja számos fenotípusos osztályba tartozó recesszív mutációk izolálása, az egér 11-es kromoszómát célozza, amely egy génben gazdag kromoszóma, amely nagymértékben konzerválódik az emberi 17-es kromoszómával. A cél a kromoszóma mutációkkal való telítése a génfunkció meghatározása érdekében, majd az egér és az ember közötti kapcsolat konzerváltságának felhasználása a génfunkció előrejelzésére az emberben. A Cre /loxP mérnökséggel létrehozott genetikai reagensek felhasználásával két mutagenezis sémát hajtanak végre: kétgenerációs deléciós törzsfákat ( 2. ábra B) és háromgenerációs törzsfákat kiegyensúlyozó kromoszómák felhasználásával ( 2. ábra C). Mindkét rendszer kihasználja a K14-agouti transzgén által biztosított sárga szőrszínt. A deléciós séma csak olyan nagy deléciók esetében használható, amelyek nem károsak az állatra nézve, így a szűrés bizonyos régiókra korlátozódik, de a mutációkat csak két generáció alatt lehet izolálni. Az inverziós séma lehetővé teszi a kromoszóma nagyobb részének mutációs szűrését, de három generációs tenyésztést igényel.
Pontmutációk azonosítása
Ahhoz, hogy értékesek legyenek, az új mutációkat lokalizálni kell, hogy a jelölt géneket és a releváns humán betegségmodelleket azonosítani lehessen. A fenotípusuk alapján izolált pontmutációkat a fenotípus-információk felhasználásával kell feltérképezni, mivel molekuláris címke nem áll rendelkezésre. Hagyományosan ezeket a mutációkat meiotikus visszakeresztezésekben térképezik fel, amelyek a fenotípust több molekuláris polimorfizmushoz viszonyítva szegregálják (áttekintésért lásd 26. hivatkozás). A 10 cM felbontású térképezéshez 100 meiózis elemzése szükséges. Így 100 új, az egész genomra izolált mutációhoz 10 000 egér elemzésére lenne szükség. A nagy felbontású térképezési stratégiák a pozíciós klónozáshoz általában 1000-2000 meiózis elemzését igénylik mutációnként. Domináns és recesszív mutációk sokasága izolálható bármely ENU-szűrés során, ami a folyamat szűk keresztmetszetévé teszi a térképezést, és egyszerűbb térképezési technológiákat, például DNS-összevonást igényel ( 27 ). A fent leírt, szőrszínnel jelölt szűrések egyedülállóak abban, hogy a mutációt látható kromoszómamarkerekhez kötve izolálják, így a mutáció kromoszómahelye az izoláláskor ismert, ami kiküszöböli a meiotikus térképezés szükségességét. Továbbá a Cre /loxP által létrehozott deléciók segítségével a mutációkat egy szubkromoszómális régióra lehet lokalizálni a nem-komplementáció révén ( 22 , 28 ). Mivel az egérgenom szekvenciája hamarosan rendelkezésre fog állni, számos mutációt a lokalizációjukat követően pozíciós jelölés alapján lehet majd génekhez rendelni. Ezenkívül a BAC-komplementáció felhasználható a mutáció-gén korrelációk azonosítására ( 29 ).
( A ) Kromoszómaátrendeződések létrehozása Cre /loxP segítségével . Két lambda egér genomikus könyvtárat állítottunk elő, amelyek tartalmazzák a kétlépéses célzási eseményekhez szükséges szelektálható markereket. Az egyik a szelektálható markert neomicint ( Neo ), a hipoxantin-foszforibozil-transzferáz ( Hprt ) 5′ végét, egy loxP-helyet és a tirozináz minigént ( Ty ) tartalmazza. A második könyvtár a szelektálható markert, a puromicint ( Puro ), a Hpr 3′ végét, egy loxP-helyet és a K14-Agouti transzgént ( Ag ) tartalmazza. Ha a loxP-helyek azonos orientációban, ciszben kerülnek beillesztésre, a Cref-transzekciót követő rekombináció deléciót és HAT-rezisztens, Puro-érzékeny, Neo-érzékeny ES-sejteket eredményez. Ha a loxP-helyek ellentétes orientációban kerülnek beillesztésre, a Cre-transzfekciót követő rekombináció inverziót eredményez, HAT-rezisztens, Puro-rezisztens, Neo-rezisztens ES-sejtekkel. (B és C) Mutagenezis sémák egér 11-es kromoszómára sárga szőrszínnel jelölt kromoszómaátrendeződések felhasználásával. A deléciót vagy inverziót egy domináns sárga szőrszín markerrel, a K-14-agutival (sárga) jelöltük. Mindegyik séma a domináns Rex ( Re , és a fekete kromoszómával jelzett) mutációt használja a Chr 11-en, amely göndör szőrzetet (foltos) okoz. Minden sémában vad típusú hímeket (C57BL/6J, fekete) injektáltak 3 × 100 mg/kg ENU-dózissal. (B) A deléciós séma. A termékenység visszanyerése után az ENU-val kezelt hímeket homozigóta Re/Re nőstényekkel párosítjuk. A Re mutáció jelöli a nem mutagenizált kromoszómát, azzal a fenntartással, hogy rekombináció történhet egy új kapcsolt mutáció és a Re között. Az ENU-val mutagénezett kromoszómák és a Re szempontjából heterozigóta G1 állatokat olyan egerekkel párosítjuk, amelyek hemizigóták egy sárga jelölésű delécióra. Az így létrejövő utódosztályok könnyen azonosíthatók: (i) a mutáns osztály sárga és egyenes szőrű, és ha hiányzik, a letális mutáció valószínűségét jelzi; (ii) egy hordozó osztály, amely vad típusú, és felhasználható az esetleges letális mutációk helyreállítására; (iii) két göndör szőrű egérosztály (fekete és sárga), amelyek nem informatívak, és azonnal elvethetők. ( C ) Az inverziós séma. A balancer kromoszóma olyan inverziót tartalmaz, amely egy ésszerű, 20-30 cM-es intervallumban elnyomja a rekombinációt, a sárga szőrszínt kölcsönző domináns K14-aguti transzgénnel van jelölve, és homozigóta letális egy vagy több letális gén megszakadása miatt a végpontjain. A termékenység visszanyerése után az ENU-val kezelt hímeket a kiegyensúlyozó kromoszómát (sárga) hordozó nőstényekkel párosítják. A sárga színű G1 állatokat a balancer kromoszómára és Re-re heterozigóta (sárga foltos) állatokkal párosítják. A második generációban az utódok három osztálya azonosítható, és a negyedik osztály, amely a balancer kromoszómára homozigóta, elpusztul (fejjel lefelé). A hasznos G2 állatok a sárga, egyenes szőrű állatok, amelyek testvér-testvér párosításban vannak. A G3-as utódok könnyen osztályozhatók: (i) a vad típusú mutáns osztály, amelynek hiánya a kapcsolódó letális mutáció valószínűségét jelzi, és (ii) a minden letális mutációt megmentő hordozó osztály, amely a kiegyensúlyozott pontmutációt hordozza, ideális állományfenntartásra.
( A ) Kromoszómaátrendeződések létrehozása Cre /loxP segítségével . Két lambda egér genomikus könyvtárat állítottunk elő, amelyek tartalmazzák a kétlépéses célzási eseményekhez szükséges szelektálható markereket. Az egyik a szelektálható markert neomicint ( Neo ), a hipoxantin-foszforibozil-transzferáz ( Hprt ) 5′ végét, egy loxP-helyet és a tirozináz minigént ( Ty ) tartalmazza. A második könyvtár a szelektálható markert, a puromicint ( Puro ), a Hpr 3′ végét, egy loxP-helyet és a K14-Agouti transzgént ( Ag ) tartalmazza. Ha a loxP-helyeket azonos orientációban in cis beillesztjük, a Cref-transzekciót követő rekombináció deléciót és HAT-rezisztens, Puro-érzékeny, Neo-érzékeny ES-sejteket eredményez. Ha a loxP-helyek ellentétes orientációban kerülnek beillesztésre, a Cre-transzfekciót követő rekombináció inverziót eredményez, HAT-rezisztens, Puro-rezisztens, Neo-rezisztens ES-sejtekkel. (B és C) Mutagenezis sémák egér 11-es kromoszómára sárga szőrszínnel jelölt kromoszómaátrendeződések felhasználásával. A deléciót vagy inverziót egy domináns sárga szőrszín markerrel, a K-14-agutival (sárga) jelöltük. Mindegyik séma a domináns Rex ( Re , és a fekete kromoszómával jelzett) mutációt használja a Chr 11-en, amely göndör szőrzetet (foltos) okoz. Minden sémában vad típusú hímeket (C57BL/6J, fekete) injektáltak 3 × 100 mg/kg ENU-dózissal. (B) A deléciós séma. A termékenység visszanyerése után az ENU-val kezelt hímeket homozigóta Re/Re nőstényekkel párosítjuk. A Re mutáció jelöli a nem mutagenizált kromoszómát, azzal a fenntartással, hogy rekombináció történhet egy új kapcsolt mutáció és a Re között. Az ENU-val mutagénezett kromoszómák és a Re szempontjából heterozigóta G1 állatokat olyan egerekkel párosítjuk, amelyek hemizigóták egy sárga jelölésű delécióra. Az így létrejövő utódosztályok könnyen azonosíthatók: (i) a mutáns osztály sárga és egyenes szőrű, és ha hiányzik, a letális mutáció valószínűségét jelzi; (ii) egy hordozó osztály, amely vad típusú, és felhasználható az esetleges letális mutációk helyreállítására; (iii) két göndör szőrű egérosztály (fekete és sárga), amelyek nem informatívak, és azonnal elvethetők. ( C ) Az inverziós séma. A balancer kromoszóma olyan inverziót tartalmaz, amely egy ésszerű, 20-30 cM-es intervallumban elnyomja a rekombinációt, a sárga szőrszínt kölcsönző domináns K14-aguti transzgénnel van jelölve, és homozigóta letális egy vagy több letális gén megszakadása miatt a végpontjain. A termékenység visszanyerése után az ENU-val kezelt hímeket a kiegyensúlyozó kromoszómát (sárga) hordozó nőstényekkel párosítják. A sárga színű G1 állatokat a balancer kromoszómára és Re-re heterozigóta (sárga foltos) állatokkal párosítják. A második generációban az utódok három osztálya azonosítható, és a negyedik osztály, amely a balancer kromoszómára homozigóta, elpusztul (fejjel lefelé). A hasznos G2 állatok a sárga, egyenes szőrű állatok, amelyek testvér-testvér párosításban vannak. A G3-as utódok könnyen osztályozhatók: (i) a vad típusú mutáns osztály, amelynek hiánya a kapcsolódó letális mutáció valószínűségét jelzi, és (ii) a minden letális mutációt megmentő hordozó osztály, amely a kiegyensúlyozott pontmutációt hordozza, ideális állományfenntartásra.
Mivel új technológiákat fejlesztenek ki a nagy áteresztőképességű egynukleotid-polimorfizmusok kimutatására, a pontmutációk kimutatására szolgáló technológiák egyszerűbbé válnak ( 30 , 31 ). Az emberrel ellentétben az egerek beltenyésztett törzseiben ritkák a természetesen előforduló polimorfizmusok, különösen a kódoló régiókban. Így a pontmutációk kimutatása beltenyésztett törzsháttérben is lehetséges, ami a mutációk mismatch repair enzimekkel történő kimutatását potenciális megközelítéssé teszi az elváltozások gyors feltérképezésére és azonosítására.
Betegségfenotípusok szűrése
A mutációk ENU-val történő szűrése során a mutációk izolálása a fenotípus vizsgálatára támaszkodik, ami megköveteli, hogy a mutáns fenotípus jelentősen eltérjen a háttértől. A mutációk szűrése azonban sok állat elemzését igényli, ezért a fenotípusszűréseknek széleskörűnek és olcsónak kell lenniük. A szemet, a szőrzetet, a méretet vagy a neurológiai viselkedést érintő látható fenotípusok egyszerűen azonosíthatók, és az ilyen szűrések gyakran eredményeznek új mutációkat. A viselkedés és az érzékszervek fenotípusai a reflexek, a látás- vagy halláskárosodás, a motoros fejlődés, az egyensúly és a koordináció, valamint a tanulás és a memória standard tesztjeivel szűrhetők. A csontváz fejlődése és a lágyrészek morfológiája nagy felbontású, alacsony energiájú röntgenvizsgálattal vizsgálható. Az egérvéren végzett klinikai vizsgálatok az emberi klinikai betegségek szempontjából releváns fenotípusok széles skáláját eredményezhetik, még akkor is, ha az egér testnedveken végzett vizsgálatokat mikroszinten kell elvégezni. Az emberi csecsemőkön már létező mikroméretű tesztek miatt számos klinikai teszt már rendelkezésre áll. A teljes vérkép mikroszkópos differenciálanalízissel azonosíthatja a vörösvértestek és fehérvérsejtek számának vagy morfológiájának rendellenességeit, valamint a vérlemezkék rendellenességeit. A vérsejtek áramlási citometriával történő elemzésének kiterjesztése más immunológiai rendellenességeket is feltárhat. Az antinukleáris antitestek kvantitatív meghatározása számos autoimmun betegségben, köztük a szisztémás lupus erythematosusban is kimutathatja a szérum autoantitesteket. A klinikai kémiai vizsgálatok számos szervrendszeri rendellenességet diagnosztizálhatnak, beleértve a máj, a hasnyálmirigy, a szív és a vese rendellenességeit. Az egerek vizeletvizsgálata kimutatja a megnövekedett fehérjeszintet vagy a betegség egyéb kóros melléktermékeit. A tandem tömegspektrometria számos, a lipideket, zsírsavakat vagy aminosavakat érintő anyagcserezavar kimutatására alkalmas. További vizsgálatokat fejlesztenek ki neurológiai, kardiovaszkuláris, vérképzőszervi és immunfenotípusok azonosítására nagy áteresztőképességű technológiák, például microarrays segítségével.
Mutáns egérforrás. Kezdetben a Baylor College of Medicine-ben egy mutáns egér erőforrást fejlesztenek ki az egér 11-es kromoszómájára, és itt az egérben rendelkezésre álló genetikai erőforrások típusainak bemutatására szolgál. Ideális esetben ilyen erőforrásokat más egérkromoszómákra is kifejlesztenek. A mutáns erőforrás különböző mutációkból áll majd, beleértve az ENU által indukált pontmutációkat, célzott génmegszakításokat és inszerciókat, valamint genetikai reagenseket, például deléciókat és inverziókat. Ezek a mutációk a kromoszóma funkcionális térképét fogják alkotni, és molekuláris intervallumokban lesznek lokalizálva, így a BAC és YAC kontigokból álló fizikai térképhez rögzíthetők lesznek. Az egérgenom szekvenálásakor a mutációkat a molekuláris intervallumokban található jelölt génekkel lehet majd korrelálni.
Mutáns egérforrás. Kezdetben a Baylor College of Medicine-ben egy mutáns egér erőforrást fejlesztenek ki az egér 11-es kromoszómájára, és itt az egérben rendelkezésre álló genetikai erőforrás típusainak bemutatására szolgál. Ideális esetben ilyen erőforrásokat más egérkromoszómákra is kifejlesztenek. A mutáns erőforrás különböző mutációkból áll majd, beleértve az ENU által indukált pontmutációkat, célzott génmegszakításokat és inszerciókat, valamint genetikai reagenseket, például deléciókat és inverziókat. Ezek a mutációk a kromoszóma funkcionális térképét fogják alkotni, és molekuláris intervallumokban lesznek lokalizálva, így a BAC és YAC kontigokból álló fizikai térképhez rögzíthetők lesznek. Az egérgenom szekvenálásakor a mutációkat a molekuláris intervallumokban található jelölt génekkel lehet majd korrelálni.
Mutáns egerek erőforrásainak létrehozása
A nagyszámú mutáció létrehozása új etikai és tudományos kérdéseket fog felvetni az egérközösségen belül: új adatbázisokra és fenotípusvizsgálatokra lesz szükség, a kriokonzervált vagy fagyasztva szárított spermából történő költséghatékony mutáció-visszanyerés létfontosságú lesz, valamint az állatok gondozásával és költségeivel kapcsolatos kérdések merülnek fel. Ezek az erőfeszítések óriási befektetést igényelnek az egérforrásokba.
Genetikai erőforrások
Az egér jelenleg rendelkezésre álló leghatékonyabb genetikai erőforrásai közé tartoznak a beltenyésztett törzsek. E törzsek genetikai sokféleségének további meghatározása az egérközösség egyik prioritása, és jelenleg is folynak erőfeszítések egy törzsjellemző adatbázis kialakítására. Ehhez a beltenyésztett törzsek elemzése szükséges számos fenotípusos paraméter tekintetében, beleértve a klinikai hematológiát és kémiát, patológiát, viselkedést és fiziológiát.
A nagyszámú egérmutáció fenntartásához, elemzéséhez és feltérképezéséhez genetikai erőforrások létrehozására lesz szükség a költségek csökkentése és a hibák csökkentése érdekében. Az olyan genetikai reagenseket, mint például a deléciók, különböző módszerekkel fejlesztik ki, beleértve a Cre/ loxP-t és a sugárzást ( 22 , 23 , 25 , 32 , 33 ). A kiegyensúlyozó kromoszómákat jelenleg gyorsan és hatékonyan lehet létrehozni a Cre/loxP megközelítéssel ( 24 , 25 ). A humán YAC-okat vagy BAC-okat tartalmazó transzgénikus egerek hasznosak lehetnek a komplementációs és mentési vizsgálatokban ( 34 ). Mivel a mutáns fenotípusok különböző beltenyésztett törzsháttereken változhatnak, a genetikai reagenseket standard genetikai háttereken is fenn kell tartani.
Archiválás
Az egérállományok nagy számban történő előállítása megköveteli az állományok hatékony archiválását és rekonstrukcióját. Az egérembriók kriokonzerválással történő tárolása hatékony technika, amelyet már több mint egy évtizede alkalmaznak. A közelmúltban a spermiumok kriokonzerválásában elért sikerek ezt a technikát kezelhetővé tették ( 35-37 ). Az egérspermiumok különösen az állományok helyreállítására használhatók számos asszisztált reprodukciós technológiával: mesterséges megtermékenyítéssel, in vitro megtermékenyítéssel és intracitoplazmatikus spermiuminjekcióval (ICSI) ( 38 ). Az egértörzsek sikeres rekonstrukciója fagyasztva szárított spermiumokból ICSI segítségével egy másik módszert biztosíthat az egértörzsek archiválására és újjáélesztésére ( 39 ).
Adatbázisok
Az egér genetikai és fenotípusos adatok kezeléséhez már szükség van adatbázisokra. Az elsődleges egéradatbázis a Jackson Laboratory-ban (Bar Harbor, ME; http://www.informatics.jax.org ) található egérgenom-adatbázis, amely egy egérlokusz-katalógust tartalmaz, amely leírja a létező egérmutánsokat, és kiterjedt térképi információkat tartalmaz azok elhelyezkedéséről. A mutáns egerek keresésének egyszerűsítése érdekében nemrégiben kifejlesztették az International Mouse Strain Resource-t ( 40 ), amely két weboldalon is megtalálható: a Jackson Laboratory (www.jax.org/pub-cgi/imsrlist) és az MRC, Harwell (imsr.har.mrc.ac.uk/). Ezenkívül nagy mennyiségű fenotípusadat halmozódik fel nagyszámú mutáns egértörzsről, ami szükségessé teszi olyan fenotípus-adatbázisok létrehozását, amelyek összekapcsolhatók a térképezési és mutagenezis-adatbázisokkal.
Disztribúció
Ahhoz, hogy genetikai erőforrást nyújtsunk a közösség számára, a mutáns egereknek könnyen hozzáférhetőnek kell lenniük. Bár számos mutáns állomány elérhető kereskedelmi forgalmazóktól vagy a Jackson Laboratóriumtól, további elosztóközpontokra van szükség. Ennek az igénynek a kielégítésére több, az NIH által finanszírozott Mutáns Egér Erőforrás Központ fog állományarchívumként és elosztó központként szolgálni az USA különböző régióiban. Az Európai Mutáns Egér Archívum a Monteretondo (Róma, Olaszország), a CNRS (Orleans, Franciaország), a Gulbenkian Intézet (Lisszabon, Portugália) és a Karolinska Intézet (Huddings, Svédország) csomópontjaival az európai erőfeszítések erőforrása. Ezek az erőforrásközpontok a mutáns egértörzsek minden típusának terjesztésére szolgálnak.
A jövő fényesnek tűnik
A következő évtizedben nagyszámú mutáns egérállományt fognak létrehozni, amelyek deléciókat, duplikációkat, kiegyensúlyozó kromoszómákat, célzott zavarokat, géncsapdákat, retrovírusos vagy transzgénikus beillesztéseket és pontmutációkat hordozó egereket tartalmaznak majd. Ezeknek a mutációknak a mutáns egérforrásba történő összeállításához szükség lesz a mutációk egérben elfoglalt helyének pontosítására és az emberben elfoglalt helyük előrejelzésére. A mutációk a genom funkcionális térképét fogják létrehozni, amely a szekvencia- és transzkript-térképpel korrelálva gazdag funkcionális információforrást biztosít ( 3. ábra ). Már nagyszámú ENU-indukált mutációt hoztak létre, amelyek az emlős genom mutációs potenciáljának csak egy töredékét képviselik, és a további kísérletek új humán betegségmodelleket fognak létrehozni és új emlősök fejlődési útvonalakat fognak feltárni. Az emlősök génműködéséről alkotott képünket ezek a kísérletek drámaian és tartósan meg fogják változtatni, ami nagyban befolyásolja majd a gyógyszerfejlesztést és az emberi egészséget.
Köszönet
A szerzők köszönetet mondanak Yin-Chai Cheah-nak a kézirat véglegesítésében nyújtott segítségéért. A Kromoszóma 11 munkáját az Egyesült Államok Közegészségügyi Minisztériumának P01 CA75719 számú pályázata finanszírozza. A.B. a Howard Hughes Medical Institute kutatója.
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
pg.
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
pg.
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
.
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.