- Abstract
- Introdução
- Mutagenização da linha germinal do rato
- Modelos de doenças isolantes Usando ENU
- Telas de grande escala
- Telas em escala real
- Combinando abordagens genéticas e fenotípicas
- Identificação de mutações pontuais
- Tela para os fenótipos da doença
- Recursos Geradores para Ratos Mutantes
- Recursos genéticos
- Arquivamento
- Bases de dados
- Distribuição
- The Future Looks Bright
- Avalores
Abstract
O progresso da sequenciação do genoma humano está a impulsionar abordagens genéticas para definir a função genética. Estratégias como armadilhas genéticas e mutagênese química logo gerarão um grande recurso mutante do rato. Mutações pontuais induzidas por N -etil- N -nitrosourea (ENU) fornecem um recurso mutante único, pois elas: (i) refletem as conseqüências de uma única mudança genética independente dos efeitos de posição; (ii) fornecem uma dissecção fina da estrutura da função da proteína; (iii) mostram uma gama de efeitos mutantes desde a perda completa ou parcial da função até a função exagerada; e (iv) descobrem as funções gênicas de forma imparcial. As telas do ENU orientadas por fenótipos no rato estão a enfatizar a relevância para a doença clínica humana, visando a cardiologia, fisiologia, neurologia, imunidade, hematopoiese e desenvolvimento de mamíferos. Tais abordagens são extremamente poderosas na compreensão de doenças e traços humanos complexos: as mudanças de pares de base podem modelar com precisão mudanças de base encontradas em doenças humanas, e alelos mutantes sutis em um fundo genético padrão fornecem a capacidade de analisar as conseqüências de genótipos compostos. Experimentos contínuos de mutagênese ENU em ratos estão gerando um tesouro de novas mutações para permitir um estudo profundo de um único gene, de uma região cromossômica ou de um sistema biológico.
Introdução
As ferramentas genéticas manipulativas no rato são extensas e poderosas. Os geneticistas de camundongos podem eliminar ou sobreexpressar genes em todo o animal ou em um tecido específico, introduzir grandes pedaços de DNA próprio ou estranho no genoma e engendrar cromossomos inteiros. Estas técnicas, combinadas com as semelhanças genéticas, de desenvolvimento, patológicas e fisiológicas entre o rato e o humano, estabeleceram o rato de laboratório como um organismo modelo primário para a investigação de doenças humanas. Cepas consanguíneas de camundongos proporcionam a oportunidade de estudar um traço de doença em um background genético definido, permitindo distinguir entre os fenótipos conferidos por uma única mutação versus as contribuições de outros modificadores genéticos.
A capacidade de engendrar a perda de mutações funcionais por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias foi pioneira em uma revolução na biologia do camundongo. Usando tecnologia de células-tronco embrionárias, qualquer gene envolvido na doença humana pode ser perturbado, fornecendo informações valiosas sobre as consequências da mutação em todo o animal. Embora sejam necessárias mutações nulas, as mutações subtis induzidas pela N -etil- N -nitrosourea (ENU) são inestimáveis para examinar toda a gama de funções do gene. Mutações em regiões de codificação e elementos reguladores podem produzir fenótipos muito diferentes enquanto fornecem uma dissecção de estrutura fina da função da proteína e regulação gênica. Séries de alelos podem ser geradas por recombinação homóloga, mas a mutagênese orientada por fenótipos oferece muitas vantagens na velocidade de geração e remoção do viés do investigador. Portanto, uma base de dados eliminatória para o genoma do rato deve ser considerada apenas como um ponto de partida; alelos adicionais e especificidades dos tecidos são obrigatórios para completar a análise funcional.
Mutagenização da linha germinal do rato
ENU pode transferir seu grupo etílico para radicais de oxigênio ou nitrogênio no DNA, resultando em desparasitação e substituição do par de base se não for reparado. As maiores taxas de mutação ocorrem em células-tronco espermatogónias pré-minióticas, com frequências de mutação de um único locus de 6–1,5 × 10 -3 ( 1-3 ), equivalente à obtenção de uma mutação num único gene de escolha num de cada 175-655 gametas rastreados. Devido ao seu poder de isolar as mutações em qualquer gene ou região de interesse, o ENU tem sido usado no mouse para: (i) obter séries multialélicas de genes únicos para definir melhor a função; (ii) dissecar vias bioquímicas ou de desenvolvimento; (iii) obter novas mutações recessivas em um único cromossomo ou em todo o genoma; e (iv) saturar regiões do genoma do camundongo que são descobertas por deleções ( 4-10 ). A análise de 62 mutações na linha germinal sequenciadas de 24 genes revela que o ENU modifica predominantemente os pares de bases A/T, com 44% de transições A/T→T/A, 38% de transições A/T→G/C, 8% de transições G/C C→C/T, 3% de transições G/C→C/G, 5% de transições A/T→C/G e 2% de transições G/C→T/A ( Tabela 1 ; Fig. 1 ). Quando traduzidas em um produto protéico, estas mudanças resultam em 64% de mutações de falta de sentido, 10% de mutações sem sentido e 26% de erros de emenda ( Tabela 1 ; Fig. 1 ).
Por ser um mutagénico pontual, a ENU pode induzir muitos tipos diferentes de alelo. Mutações por perda de função, hipomorfos viáveis de grupos de complementação letais, antimorfos e mutações por ganho de função foram isolados em telas de mutagênese de camundongos ( 4 , 9-16 ). Séries de alelos em loci simples são extremamente poderosos quando analisados em conjunto para definir a função. Séries alélicas em loci complexos podem perturbar isoformas proteicas individuais, levando à descoberta de funções distintas em vários tecidos ao longo da vida de um organismo ( 17 ). Um exemplo marcante de uma série alélica deste tipo é o locus tremor ( qk ). Antes do isolamento dos alelos induzidos pelo ENU, o locus tremor foi definido por um único alelo espontâneo, qkV , com um fenótipo homozigoto de convulsões e tremores causados por dismielinização grave do sistema nervoso central (SNC) ( 18 ). Os alelos induzidos pelo ENU, entretanto, revelam que o tremor também funciona durante a embriogênese ( 7 , 13 ). Homozigotos de quatro dos cinco alelos induzidos pelo ENU ( qk1-1 , qkkt1 , qkkk2 , qkkt3/4 ) morrem em dias embrionários (E) 8,5-10,5 com defeitos do SNC, enquanto apenas um é viável com tremores e convulsões ( qke5 ) (19; J.K. Noveroske e M.J. Justice, dados não publicados). Embora os alelos tremores possam ser agrupados com base na letalidade embrionária ou dismielinização viável, cada alelo se desvia de alguma forma significativa desses fenótipos gerais para torná-lo um recurso único e valioso para estudos de estrutura/função fina e modelagem de defeitos do tubo neural humano, bem como distúrbios de convulsões e mielinização ( Tabela 2 ). Séries alélicas geradas por ENU ou genes direcionados a outros loci complexos serão ferramentas valiosas para dissecar a função protéica ( 17 ).
Sumário de mutações sequenciadas induzidas por ENU
Sumário de mutações sequenciadas por ENU-mutações induzidas
Mutagénese de ENU para isolar as mutações. O ENU induz lesões no DNA das células estaminais espermatogónias de ratinhos, afectando principalmente os pares de bases AT. Estas lesões estão presentes no esperma do macho, e após o seu isolamento através de telas genéticas e fenotípicas, dão origem a uma variedade de mutações fenotípicas. Os produtos proteicos mutantes são principalmente mutações erróticas, uma classe valiosa de mutações para dissecar a estrutura e função da proteína. Mutagênese no mouse enfatizará a modelagem de doenças humanas por meio de ensaios de feno-tipo.
Mutagênese deENU para isolar as mutações. O ENU induz lesões no DNA das células estaminais espermatogónias de ratinhos, afectando principalmente os pares de bases AT. Estas lesões estão presentes no esperma do macho, e após o seu isolamento através de telas genéticas e fenotípicas, dão origem a uma variedade de mutações fenotípicas. Os produtos proteicos mutantes são principalmente mutações erróticas, uma classe valiosa de mutações para dissecar a estrutura e função da proteína. Mutagênese no mouse enfatizará a modelagem de doenças humanas por meio de ensaios conduzidos por feno-tipo.
Modelos de doenças isolantes Usando ENU
Telas genéticas diferentes podem ser usadas para isolar as mutações induzidas por ENU. Uma única tela de geração pode gerar rapidamente mutantes viáveis e férteis que representam séries de alelos, modificadores ou mutações dominantes. Telas de deleção de duas gerações podem identificar mutações letais recessivas em uma região definida do genoma. Telas de pedigree de três gerações podem ser usadas para escanear todo o genoma em busca de uma mutação viável de interesse ou, em combinação com marcadores ligados ou cromossomos equilibradores, para isolar alelos letais ou estéreis (ver abaixo).
Telas de grande escala
Várias telas de mutagênese em larga escala já foram financiadas internacionalmente. As principais características destas telas estão resumidas na Tabela 3 . Cada uma destas telas usa uma estratégia genética diferente para isolar as mutações: algumas telas têm como alvo as mutações dominantes, enquanto outras são projetadas para isolar as mutações recessivas. Alguns grupos estão rastreando mutações recessivas letais e prejudiciais com mutagênese regional para abordar a função gênica em paralelo com o Projeto Genoma Humano. Outros grupos estão examinando grandes números de genomas mutagenizados para hematologia neurológica e clínica dominante ou variantes bioquímicas.
Telas em escala real
A triagem para mutações não precisa ser realizada em larga escala. Duas estratégias rentáveis para o pequeno laboratório são as séries alélicas e as telas sensibilizadas. Uma triagem de via sensibilizada visa uma única via biológica ou bioquímica, e explora a não-complementação não alélica para isolar as mutações na primeira geração de descendentes de machos mutagenizados. Em tal tela, uma mutação induzida (*) em um locus que interage com o locus de interesse ( m ) pode não complementar (*/+;+/ m ), mas produzir um fenótipo que lembra o mutante homozigoto original ( m/m ). Algumas telas sensibilizadas podem ser realizadas no fundo de uma droga ou modificação ambiental, ao invés de uma modificação genética. Por exemplo, utilizando uma injeção de fenilalanina como sensibilizador, várias mutações que afetam a via do metabolismo da fenilalanina foram isoladas como heterozigotos ( 20 , 21 ).
Combinando abordagens genéticas e fenotípicas
Uma abordagem única para isolar mutações combina a focalização genética em células estaminais embrionárias com a mutagénese ENU fenotípica. Poderosas estratégias genéticas em Drosophila dependem da disponibilidade de reagentes genéticos como deleções, duplicações e inversões para facilitar as telas genéticas e proporcionar uma manutenção de estoque simples e econômica. As deleções são úteis para gerar haploidia em telas genéticas, bem como para o mapeamento utilizando estratégias de não-complementação ( Fig. 2 B) ( 22 ). Inversões que carregam um marcador dominante e são homozigotos letais são cromossomos equilibradores ideais para suprimir a recombinação e identificar prontamente classes de descendentes para o isolamento e manutenção de mutações letais ou prejudiciais ( Fig. 2 C). A capacidade de engendrar regiões cromossômicas inteiras usando tecnologias Cre /loxP permite a criação desses reagentes genéticos em um processo de focalização genética em duas etapas ( Fig. 2 A) ( 23 , 24 ). A abordagem é baseada no gene porque os pontos finais da eliminação ou inversão são conhecidos, minimizando a quantidade de esforço necessária para caracterizar os rearranjos. As técnicas de engenharia permitem que os rearranjos sejam marcados com um marcador de cor amarelo dominante, K-14 agouti , fornecendo um recurso para mapeamento simples, manutenção de estoques e telas genéticas ( 22 , 24 , 25 ). A criação de bibliotecas genômicas de ratos contendo as construções necessárias para os eventos de alvo fornece um sistema rápido para sua geração em qualquer parte do genoma do rato ( Fig. 2 A) ( 25 ).
Características únicas dos alelos agudos
Características únicas dos alelos agudos
Funded large-escala Telas ENU
Telas ENU de grande escala financiadas
Um esforço inicial de mutagênese, Concebido para isolar mutações recessivas de muitas classes fenotípicas, visa o cromossoma 11 do rato, que é um cromossoma rico em genes altamente conservado com o cromossoma 17 humano. O objetivo é saturar o cromossomo com mutações para definir a função do gene e depois usar a conservação da ligação entre o rato e o humano para prever a função do gene no humano. Usando os reagentes genéticos gerados pela engenharia Cre /loxP, dois esquemas de mutagênese estão sendo realizados: pedigrees de deleção de duas gerações ( Fig. 2 B) e pedigrees de três gerações usando cromossomos equilibradores ( Fig. 2 C). Ambos os esquemas aproveitam a cor da pelagem amarela conferida pelo transgene K14-agouti. O esquema de eliminação só pode ser usado para grandes deleções que não sejam prejudiciais ao animal, limitando a tela a certas regiões, mas permitindo que as mutações sejam isoladas em apenas duas gerações. O esquema de inversão permite que uma porção maior do cromossoma seja rastreada para mutações, mas requer três gerações de criação.
Identificação de mutações pontuais
Para serem valiosas, novas mutações devem ser localizadas para que genes candidatos e modelos relevantes de doenças humanas possam ser identificados. As mutações pontuais isoladas pelo fenótipo devem ser mapeadas utilizando informação fenotípica, uma vez que não está disponível uma etiqueta molecular. Tradicionalmente, estas mutações são mapeadas em retrocruzamentos meióticos segregando o fenótipo em relação a múltiplos polimorfismos moleculares (para uma revisão ver ref. 26 ). Para mapear para uma resolução de 10 cM é necessário analisar 100 meiose. Assim, 100 novas mutações isoladas em todo o genoma exigiriam a análise de 10 000 ratos. Estratégias de mapeamento de alta resolução para clonagem posicional geralmente envolvem a análise de 1000-2000 meiose por mutação. Uma multidão de mutações dominantes e recessivas pode ser isolada em qualquer tela do ENU, fazendo o mapeamento do gargalo no processo, e exigindo tecnologias de mapeamento mais simples, como o agrupamento de DNA ( 27 ). As telas com marcação colorida descritas acima são únicas, pois a mutação é isolada ligada a marcadores cromossômicos visíveis, de modo que sua localização cromossômica é conhecida após o isolamento, eliminando a necessidade de mapeamento meiótico. Além disso, as deleções geradas pelo Cre/loxP podem ser usadas para localizar as mutações para uma região sub cromossômica por não-complementação ( 22 , 28 ). Como a seqüência do genoma do mouse logo estará disponível, muitas mutações serão atribuídas a genes com base na candidatura posicional após a sua localização. Além disso, a complementação de BAC pode ser usada para identificar correlações mutação-gene ( 29 ).
( A ) Geração de rearranjos cromossômicos usando Cre /loxP . Foram construídas duas bibliotecas genômicas de mouse lambda que contêm os marcadores selecionáveis necessários para os eventos de dois passos de direcionamento. Uma contém o marcador selecionável neomicina ( Neo ), a ponta 5′ de hipoxantina fosforibosiltransferase ( Hprt ), um site loxP e o minigene Tyrosinase ( Ty ). A segunda biblioteca contém o marcador selecionável puromycin ( Puro ), o 3′ final de Hpr , um site loxP e o transgene K14-Agouti ( Ag ). Se os locais loxP forem inseridos em cis na mesma orientação, a recombinação após a transfecção Cre produzirá uma eliminação, e células HAT resistentes, Puro sensíveis, Neo sensíveis ES. Se os locais loxP forem inseridos na orientação oposta, a recombinação após a transfecção de Cre resultará numa inversão, com células ES resistentes ao HAT, Puro e Neo resistentes. (B e C) Esquemas de mutagénese para o cromossoma 11 do rato utilizando rearranjos cromossómicos marcados com uma cor amarela. A eliminação ou inversão é marcada com um marcador de cor da pelagem amarela dominante, K-14-agouti (amarelo). Cada esquema usa o Rex dominante ( Re , e indicado pelo cromossomo preto) mutação no Chr 11, que causa o pêlo encaracolado (mosqueado). Em cada esquema, machos do tipo selvagem (C57BL/6J, preto) são injetados com uma dose de 3 × 100 mg/kg de ENU. (B) O esquema de eliminação. Após recuperarem a fertilidade, os machos tratados com ENU são acasalados com fêmeas homozigotos Re/Re. A mutação Re marca o cromossomo não-mutagênico, com a ressalva de que a recombinação pode ocorrer entre uma nova mutação ligada e o Re . G1, heterozigotos para cromossomos ENU mutagenizados e Re são acasalados a camundongos hemizigotos para uma eliminação com marcação amarela. As classes resultantes da descendência podem ser prontamente identificadas: (i) a classe mutante é amarela e de pêlo reto e, se faltar, indica a probabilidade de uma mutação letal; (ii) uma classe portadora do tipo selvagem, e pode ser usada para recuperar quaisquer mutações letais; (iii) duas classes de ratos de pêlo encaracolado (pretos e amarelos) que não são informativas e podem ser imediatamente descartadas. ( C ) O esquema de inversão. O cromossoma balancim contém uma inversão que suprime a recombinação num intervalo razoável, 20-30 cM, é marcado com o transgene K14-agouti dominante conferindo a cor da pelagem amarela, e é homozigoto letal devido à ruptura de um ou mais genes letais nos seus pontos finais. Após recuperar a fertilidade, os machos tratados com ENU são acasalados às fêmeas portadoras do cromossoma balancim (amarelo). Os animais G1 que são amarelos são acasalados com animais heterozigotos para o cromossoma balancim e Re (amarelo mosqueado). Três classes de crias podem ser identificadas na segunda geração, e a quarta classe, que é homozigotos para o cromossoma balancim, morre (de cabeça para baixo). Os animais úteis do G2 são os animais amarelos, de pêlo liso, que são irmãos-irmãs acasalados. Os descendentes de G3 são facilmente classificados como: (i) a classe mutante do tipo selvagem, que se faltar indica a probabilidade de uma mutação letal ligada e (ii) uma classe portadora de mutações letais usadas, que carrega a mutação de ponto equilibrado, ideal para a manutenção do stock.
( A ) Geração de rearranjos cromossômicos usando Cre /loxP . Foram construídas duas bibliotecas genômicas de mouse lambda que contêm os marcadores selecionáveis necessários para eventos com dois passos de segmentação. Uma contém o marcador selecionável neomicina ( Neo ), a ponta 5′ de hipoxantina fosforibosiltransferase ( Hprt ), um site loxP e o minigene Tyrosinase ( Ty ). A segunda biblioteca contém o marcador selecionável puromycin ( Puro ), o 3′ final de Hpr , um site loxP e o transgene K14-Agouti ( Ag ). Se os locais loxP são inseridos em cis na mesma orientação, a recombinação após a transfecção Cre produzirá uma eliminação, e células HAT resistentes, Puro sensíveis, Neo sensíveis ES. Se os locais loxP forem inseridos na orientação oposta, a recombinação após a transfecção de Cre resultará numa inversão, com células ES resistentes ao HAT, Puro e Neo resistentes. (B e C) Esquemas de mutagénese para o cromossoma 11 do rato utilizando rearranjos cromossómicos marcados com uma cor amarela. A eliminação ou inversão é marcada com um marcador de cor da pelagem amarela dominante, K-14-agouti (amarelo). Cada esquema usa o Rex dominante ( Re , e indicado pelo cromossomo preto) mutação no Chr 11, que causa o pêlo encaracolado (mosqueado). Em cada esquema, machos do tipo selvagem (C57BL/6J, preto) são injetados com uma dose de 3 × 100 mg/kg de ENU. (B) O esquema de eliminação. Após recuperarem a fertilidade, os machos tratados com ENU são acasalados com fêmeas homozigotos Re/Re. A mutação Re marca o cromossomo não-mutagênico, com a ressalva de que a recombinação pode ocorrer entre uma nova mutação ligada e o Re . G1, heterozigotos para cromossomos ENU mutagenizados e Re são acasalados a camundongos hemizigotos para uma eliminação com marcação amarela. As classes resultantes da descendência podem ser prontamente identificadas: (i) a classe mutante é amarela e de pêlo reto e, se faltar, indica a probabilidade de uma mutação letal; (ii) uma classe portadora do tipo selvagem, e pode ser usada para recuperar quaisquer mutações letais; (iii) duas classes de ratos de pêlo encaracolado (pretos e amarelos) que não são informativas e podem ser imediatamente descartadas. ( C ) O esquema de inversão. O cromossoma balancim contém uma inversão que suprime a recombinação num intervalo razoável, 20-30 cM, é marcado com o transgene K14-agouti dominante conferindo a cor da pelagem amarela, e é homozigoto letal devido à ruptura de um ou mais genes letais nos seus pontos finais. Após recuperar a fertilidade, os machos tratados com ENU são acasalados às fêmeas portadoras do cromossoma balancim (amarelo). Os animais G1 que são amarelos são acasalados com animais heterozigotos para o cromossoma balancim e Re (amarelo mosqueado). Três classes de crias podem ser identificadas na segunda geração, e a quarta classe, que é homozigotos para o cromossoma balancim, morre (de cabeça para baixo). Os animais úteis do G2 são os animais amarelos, de pêlo liso, que são irmãos-irmãs acasalados. Os descendentes de G3 são facilmente classificados como: (i) a classe mutante do tipo selvagem, que se faltar indica a probabilidade de uma mutação letal ligada e (ii) uma classe portadora de mutações letais usadas, que carrega a mutação de ponto equilibrado, ideal para a manutenção do stock.
À medida que novas tecnologias estão sendo desenvolvidas para a detecção de polimorfismo de nucleotídeos simples de alto rendimento, tecnologias para a detecção de mutações pontuais se tornarão mais simples ( 30 , 31 ). Ao contrário dos humanos, os polimorfismos naturais são raros nas estirpes de ratos consanguíneos, em particular nas regiões de codificação. Assim, a detecção de mutações pontuais é possível em um fundo de estirpe consanguínea, tornando a detecção de mutações com enzimas reparadoras de má combinação uma abordagem potencial para mapear e identificar rapidamente as lesões.
Tela para os fenótipos da doença
Em qualquer tela para mutações usando ENU, o isolamento da mutação depende do ensaio de fenótipo, exigindo que o fenótipo mutante varie significativamente do fundo. Entretanto, a triagem para mutações envolve a análise de muitos animais, portanto, as telas de fenótipo devem ser amplas e baratas. Fenótipos visíveis que afetam o olho, pelagem, tamanho ou comportamento neurológico são simples de identificar, e tais telas freqüentemente produzem novas mutações. Os fenótipos de órgãos sensoriais e comportamentais podem ser rastreados para a utilização de testes padrão de reflexos, perda visual ou auditiva, desenvolvimento motor, equilíbrio e coordenação, bem como aprendizagem e memória. O desenvolvimento esquelético e a morfologia dos tecidos moles podem ser examinados utilizando análises de raios X de alta resolução e baixa energia. Os testes clínicos realizados em sangue de camundongos podem produzir uma vasta gama de fenótipos relevantes para a doença clínica humana, embora os testes realizados em fluidos corporais de camundongos devam ser realizados em uma microescala. Devido aos testes em microescala existentes para bebés humanos, muitos testes clínicos já estão disponíveis. Um hemograma completo com análise diferencial microscópica pode identificar anormalidades no número de glóbulos vermelhos e glóbulos brancos ou na morfologia, assim como anormalidades plaquetárias. A extensão da análise das células sanguíneas com citometria de fluxo pode revelar outros defeitos imunológicos. A quantificação de anticorpos antinucleares pode detectar auto-anticorpos séricos numa grande variedade de doenças auto-imunes, incluindo lúpus eritematoso sistémico. Os testes químicos clínicos podem diagnosticar anomalias em múltiplos órgãos, incluindo doenças hepáticas, pancreáticas, cardíacas e renais. A urinálise em ratos revela níveis aumentados de proteínas ou outros subprodutos anormais da doença. A espectrometria de massa tandem pode detectar uma variedade de desordens metabólicas que afectam os lípidos, ácidos gordos ou aminoácidos. Estão sendo desenvolvidos ensaios adicionais para identificar fenótipos neurológicos, cardiovasculares, hematopoiéticos e imunológicos usando tecnologias de alto rendimento, como microarrays.
Um recurso mutante do rato. Inicialmente, um recurso de mouse mutante na Faculdade de Medicina Baylor será desenvolvido para o cromossomo 11, e é usado aqui como uma demonstração dos tipos de recursos genéticos que estarão disponíveis no mouse. Idealmente, tais recursos serão desenvolvidos para outros cromossomos de camundongos. O recurso mutante consistirá de uma variedade de mutações, incluindo mutações pontuais induzidas pelo ENU, interrupções e inserções de genes alvo, assim como reagentes genéticos como deleções e inversões. Estas mutações constituirão um mapa funcional do cromossoma, e serão localizadas em intervalos moleculares, para que possam ser ancoradas ao mapa físico composto por BAC e YAC contigs. Quando o genoma do rato é sequenciado, as mutações podem ser correlacionadas com genes candidatos que estão dentro dos intervalos moleculares.
Um recurso de rato mutante. Inicialmente, um recurso de mouse mutante na Faculdade de Medicina Baylor será desenvolvido para o cromossomo 11, e é usado aqui como uma demonstração dos tipos de recursos genéticos que estarão disponíveis no mouse. Idealmente, tais recursos serão desenvolvidos para outros cromossomos de camundongos. O recurso mutante consistirá de uma variedade de mutações, incluindo mutações pontuais induzidas pelo ENU, interrupções e inserções de genes alvo, assim como reagentes genéticos como deleções e inversões. Estas mutações constituirão um mapa funcional do cromossoma, e serão localizadas em intervalos moleculares, para que possam ser ancoradas ao mapa físico composto por BAC e YAC contigs. Quando o genoma do rato é sequenciado, as mutações podem ser correlacionadas com genes candidatos que estão dentro dos intervalos moleculares.
Recursos Geradores para Ratos Mutantes
A geração de grandes números de mutações criará novas questões éticas e científicas dentro da comunidade do rato: novas bases de dados e ensaios fenotípicos serão necessários, a recuperação custo-eficaz da mutação de esperma criopreservado ou liofilizado tornar-se-á essencial, e surgirão questões de cuidado e custo dos animais. Esses esforços requerem um tremendo investimento em recursos de camundongos.
Recursos genéticos
Um dos recursos genéticos mais poderosos atualmente disponíveis no camundongo são as cepas consanguíneas. Uma das prioridades da comunidade de camundongos é definir melhor a diversidade genética dessas linhagens, com esforços em andamento para desenvolver um banco de dados de características de linhagens. Isto requer a análise das linhagens consanguíneas para muitos parâmetros fenotípicos, incluindo hematologia clínica e química, patologia, comportamento e fisiologia.
A manutenção, análise e mapeamento de um grande número de mutações de camundongos exigirá a geração de recursos genéticos para diminuir os custos e reduzir os erros. Reagentes genéticos como as deleções estão sendo desenvolvidos por uma variedade de métodos incluindo Cre/ loxP e radiação ( 22 , 23 , 25 , 32 , 33 ). Cromossomos equilibradores podem atualmente ser gerados rápida e eficientemente usando abordagens Cre/loxP ( 24 , 25 ). Ratos transgênicos contendo YACs ou BACs humanos podem ser úteis em estudos de complementação e resgate ( 34 ). Como os fenótipos mutantes podem variar em diferentes origens de estirpes consanguíneas, os reagentes genéticos também devem ser mantidos em origens genéticas padrão.
Arquivamento
A geração de grandes números de estoques de camundongos requer um eficiente arquivamento e reconstituição de estoques. O armazenamento de embriões de camundongos por criopreservação é uma técnica eficaz que já vem sendo utilizada há mais de uma década. Recentemente, os sucessos na criopreservação de esperma tornaram-na numa técnica de rastreio ( 35-37 ). Em particular, o esperma de camundongo pode ser utilizado para reconstituir estoques através de uma série de tecnologias reprodutivas assistidas: inseminação artificial, fertilização in vitro e injeção intracitoplasmática de esperma (ICSI) ( 38 ). A reconstituição bem sucedida de cepas de camundongos a partir de esperma liofilizado utilizando a ICSI pode fornecer outro método para arquivar e reanimar cepas de camundongos ( 39 ).
Bases de dados
Bases de dados já são necessárias para o manuseio de dados genéticos e fenotípicos de camundongos. O banco de dados primário do mouse é o Mouse Genome Database, alojado no Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME; http://www.informatics.jax.org ), que inclui um Mouse Locus Catalogue descrevendo mutantes de mouse existentes, e contendo informações cartográficas extensas descrevendo suas localizações. Para simplificar a busca por ratos mutantes, foi desenvolvido recentemente o Recurso Internacional de Tensão de Rato ( 40 ), que é espelhado em dois websites: o Jackson Laboratory em www.jax.org/pub-cgi/imsrlist e o MRC, Harwell, em imsr.har.mrc.ac.uk/. Além disso, é provável que grandes quantidades de dados fenotípicos se acumulem em grandes números de cepas de mouse mutantes, criando a necessidade de bancos de dados fenotípicos que possam ser ligados a bancos de dados de mapeamento e mutagênese.
Distribuição
Para fornecer um recurso genético para a comunidade, os ratos mutantes devem estar prontamente disponíveis. Embora muitos estoques mutantes estejam disponíveis em fornecedores comerciais ou no Laboratório Jackson, centros de distribuição adicionais são necessários. Para atender a essa demanda, vários Centros de Recursos para Ratos Mutantes financiados pelo NIH servirão como arquivos de estoque e centros de distribuição para as várias regiões dos EUA. O Arquivo Europeu de Ratos Mutantes com nós em Monteretondo (Roma, Itália), o CNRS (Orleães, França), o Instituto Gulbenkian (Lisboa, Portugal) e o Instituto Karolinska (Huddings, Suécia) é um recurso para os esforços europeus. Estes centros de recursos são concebidos para distribuir todos os tipos de estirpes de ratos mutantes.
The Future Looks Bright
Será gerado um grande número de estoques de ratos mutantes durante a próxima década, que incluirá supressões portadoras de ratos, duplicações, cromossomas equilibradores, rupturas direccionadas, armadilhas genéticas, inserções retrovirais ou transgénicas, e mutações pontuais. A compilação dessas mutações em um recurso de mouse mutante exigirá o refinamento de sua localização no mapa do mouse e a previsão de sua localização no humano. As mutações irão gerar um mapa funcional do genoma que pode ser correlacionado com a seqüência e o mapa de transcrição para fornecer um rico recurso de informação funcional ( Fig. 3 ). Um grande número de mutações induzidas por ENU já foram produzidas que representam apenas uma fração do potencial mutacional do genoma dos mamíferos, e experimentos adicionais irão gerar novos modelos de doenças humanas e revelar novas vias de desenvolvimento dos mamíferos. Nossa visão da função dos genes em mamíferos será mudada de forma dramática e permanente por essas experiências, o que terá um grande impacto no desenvolvimento de medicamentos e na saúde humana.
Avalores
Os autores agradecem a Yin-Chai Cheah pela ajuda na finalização do manuscrito. O trabalho do Cromossoma 11 é financiado pelo Departamento de Saúde Pública dos EUA P01 CA75719. A.B. é um investigador do Howard Hughes Medical Institute.
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