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Yersinia pestis est l’agent étiologique de la peste et peut potentiellement être utilisé comme arme biologique (1, 13, 17-20, 23). Pour cette raison, il est important que la résistance émergente aux médicaments, qu’elle soit naturelle ou artificielle, puisse être détectée à l’aide de méthodes standardisées faciles à mettre en œuvre dans plusieurs laboratoires. Le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) décrit une méthode de référence de microdilution en bouillon (BMD) pour l’antibiogramme de Y. pestis et fournit des directives d’interprétation des CMI pour huit agents antimicrobiens (6). La DMB utilise un bouillon Mueller-Hinton ajusté aux cations (CAMHB) et nécessite une incubation à 35°C pendant 24 heures, avec une option d’incubation pendant 48 heures lorsque la croissance à 24 heures est insuffisante pour l’interprétation du point final. Malheureusement, la DMO de référence est difficile à intégrer dans de nombreux laboratoires car elle est relativement coûteuse et laborieuse et nécessite le stockage des panels dans un format congelé ou déshydraté. Il existe plusieurs méthodes alternatives d’antibiogramme, notamment les méthodes de diffusion sur disque et Etest. Cependant, avant que ces méthodes puissent être employées pour une espèce, elles doivent être évaluées et comparées à la DMO pour déterminer les corrélations entre les résultats obtenus par les comparaisons des méthodes.

Les isolats de Y. pestis sont fastidieux et peuvent se développer plus lentement sur des milieux artificiels que d’autres espèces courantes d’entérobactéries, et les méthodes d’antibiogramme pour Y. pestis ont donc été difficiles à standardiser. Plusieurs méthodes sont décrites dans la littérature. Les tests de diffusion en disque ont généralement été réalisés sur de la gélose Mueller-Hinton (MHA), avec une incubation de 48 heures à 35°C, mais les descriptions méthodologiques sont parfois peu détaillées (10, 16, 24). La méthode Etest a été employée par Wong et al. (25) en utilisant la MHA avec 5% de sang de mouton, une incubation à 35°C, et un inoculum correspondant à un no. 1 McFarland au lieu du standard de 0,5 McFarland utilisé dans la plupart des études de diffusion par disque ou Etest. La dilution en gélose, utilisant de l’AMH incubée entre 27° et 30°C pendant 48 h, est la méthode la plus couramment rapportée dans la littérature (7, 8, 11, 12, 22). Les méthodes de macrodilution en bouillon et de microdilution ont également été utilisées avec diverses températures d’incubation (2, 21).

Plusieurs attributs des méthodes de diffusion sur disque et d’Etest en font des méthodes alternatives attrayantes pour l’antibiogramme, notamment la facilité de stockage et la longue durée de conservation des disques et des bandes. En outre, il s’agit de méthodes basées sur la gélose et les résultats peuvent être plus faciles à lire que ceux de la DMO. L’Etest présente l’avantage supplémentaire de produire un résultat de CMI. Dans ce rapport, nous présentons les résultats d’une étude multicentrique comparant les méthodes Etest et de diffusion sur disque avec la méthode de référence CLSI BMD pour l’antibiogramme de Y. pestis.

(Ce rapport a été présenté en partie lors de la 107e assemblée générale de l’American Society for Microbiology, Toronto, Canada, 21 au 25 mai 2007.)

Vingt-six souches diverses de Y. pestis provenant des collections des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) et de l’U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) ont été testées à la fois par les méthodes Etest et BMD sur quatre sites d’essai et en plus par diffusion sur disque sur deux de ces sites. Six souches appartenaient au biovar Antiqua, sept au biovar Medievalis et 12 au biovar Orientalis ; un isolat atypique n’a pu être attribué à aucun biovar. Les agents antimicrobiens ont été testés à la fois par BMD et Etest (bioMérieux, Durham, NC), et leurs plages correspondantes étaient les suivantes pour BMD et Etest, respectivement : pour le chloramphénicol, 0,03 à 64 μg/ml et 0,016 à 256 μg/ml ; pour la ciprofloxacine, 0,03 à 64 μg/ml et 0,002 à 32 μg/ml ; pour la doxycycline, 0,03 à 64 μg/ml et 0.016 à 256 μg/ml ; pour la gentamicine, 0,03 à 64 μg/ml et 0,016 à 256 μg/ml ; pour la lévofloxacine, 0,06 à 64 μg/ml et 0,002 à 32 μg/ml ; pour la streptomycine, 0,03 à 64 μg/ml et 0.016 à 256 μg/ml ; pour la tétracycline, 0,03 à 64 μg/ml et 0,016 à 256 μg/ml ; et pour le triméthoprime-sulfaméthoxazole, 0,015/32 à 16/304 μg/ml et 0,002/0,038 à 32/608 μg/ml. Étant donné que les fourchettes pour le test BMD de certains médicaments n’englobaient pas les concentrations inférieures pouvant être obtenues par l’Etest, la concordance essentielle (± 1 log2 de dilution) entre les méthodes a été considérée comme hors échelle pour certaines comparaisons de résultats (par exemple, une CMI de lévofloxacine BMD de ≤0,06 μg/ml et une CMI Etest de 0,03 μg/ml). Au CDC, des plateaux de CMI à 96 puits ont été préparés en utilisant 100 μl de CAMHB (BBL, Sparks, MD) par puits ; les plateaux ont été conservés congelés à -70 °C et expédiés aux laboratoires participants. Les tests ont été réalisés selon les méthodes standard CLSI pour la DMO et la diffusion sur disque (4-6). Les inocula ont été préparés à partir de cultures aérobies de 18 à 24 heures sur des plaques de gélose au sang de mouton à 5 % (BBL) par la méthode de suspension directe des colonies dans un bouillon Mueller-Hinton (MHB) (Remel, Lenexa, KS) pour obtenir une turbidité standard de 0,5 McFarland (4) ; les mêmes inocula ont été utilisés pour inoculer des plaques de MHA de 150 mm de diamètre pour les tests Etest et de diffusion en disque. Immédiatement après l’inoculation, au moins deux dénombrements aléatoires de colonies ont été effectués sur chaque site d’essai avec le puits témoin de croissance positif de la DMO afin d’évaluer la taille de l’inoculum. Pas plus de quatre bandes Etest ont été appliquées sur une plaque. Pour la diffusion par disques, des disques commerciaux (BBL) ont été appliqués à l’aide d’un distributeur multidisque autotampon (BBL). Les panneaux BMD et les plaques MHA pour l’Etest et la diffusion de disques ont été incubés à 35°C et lus à des périodes de 24 et 48 heures. Les Etests ont été lus selon les instructions de la notice d’utilisation d’Etest, comme suit : le chloramphénicol, la doxycycline, la tétracycline et le triméthoprime-sulfaméthoxazole ont été lus à 80 % d’inhibition pour le point d’intersection ; la ciprofloxacine, la lévofloxacine, la gentamicine et la streptomycine ont été lus à 100 % d’inhibition. Pour les analyses de données, les CMI Etest ont été arrondies à la dilution log2 la plus proche. Escherichia coli ATCC 25922 et Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ont été utilisés pour le contrôle de qualité BMD et Etest. Les CMI des souches du contrôle de qualité ont été déterminées par incubation pendant 16 à 20 h. Les plages acceptables de contrôle de qualité BMD pour la streptomycine ont été établies précédemment au CDC (données non publiées). Le contrôle de qualité de l’Etest du chloramphénicol a été effectué en testant Escherichia coli ATCC 25922 et en appliquant la plage acceptable pour le BMD CLSI.

Pour mesurer la concordance entre les résultats de l’Etest et du BMD, la distribution des différences dans les CMI de dilution log2 a été examinée et le pourcentage de déterminations de CMI qui ont donné des valeurs identiques (concordance essentielle dans les limites de précision de la méthode de référence ) a été calculé pour chaque médicament. De plus, pour déterminer si la méthode Etest produisait des CMI significativement plus basses ou plus élevées que la méthode de référence, nous avons effectué un test de Wilcoxon signé avec les CMI de dilution log2 des deux tests à l’aide du logiciel statistique SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC) ; les CMI à ± 1 log2 de dilution ont été considérées comme identiques pour ce test. La comparaison des résultats des catégories d’interprétation (sensible, intermédiaire et résistant) a été effectuée en calculant les taux d’erreurs mineures, majeures et très majeures.

En général, les points finaux des CMI étaient plus facilement discernables par BMD que par Etest à 24 h (données non présentées). Sur trois sites d’essai (A, B et C), presque toutes les CMI BMD et Etest étaient lisibles à 24 h d’incubation ; un seul résultat Etest était l’exception. Le site D a rapporté des CMI BMD lisibles à 24 h pour toutes les souches sauf une. Il n’y avait pas assez de croissance pour lire les CMI Etest à 24 h pour huit souches au site D. Le nombre de CMI Etest illisibles en raison d’une croissance insuffisante à 24 h par médicament était le suivant : pour le chloramphénicol, n = 6 ; pour la ciprofloxacine, n = 4 ; pour la doxycycline, n = 3 ; pour la gentamicine, n = 2 ; pour la lévofloxacine, n = 5 ; pour la streptomycine, n = 5 ; pour la tétracycline, n = 4 ; et pour le triméthoprime-sulfaméthoxazole, n = 4. Tous les sites d’essai étaient en mesure de lire tous les résultats à 48 h. Par conséquent, les résultats à 48 h ont été utilisés dans la comparaison. Les dénombrements de colonies ont démontré que les densités d’inoculum dans les puits de DMO se situaient dans des limites acceptables pour les quatre sites d’essai ; les moyennes pour les sites variaient de 1,1 × 105 UFC/ml à 4,2 × 105 UFC/ml.

Les CMI90 et la plage de CMI pour chaque agent antimicrobien ont été comparées par méthode (tableau 1). Pour tous les médicaments, sauf le chloramphénicol, les CMI90 de toutes les méthodes étaient identiques ou à ± 1 log2 de dilution les unes des autres. La concordance des catégories entre les méthodes Etest et BMD pour tous les médicaments était excellente, de 97 % à 100 % ; toutes les erreurs étaient mineures (tableau 1). Toutes les CMI BMD et Etest se situaient dans la plage de sensibilité après 24 heures d’incubation (données non présentées). Après 48 heures, la plupart des CMI se situaient dans la plage de sensibilité, à l’exception des résultats non sensibles suivants : chloramphénicol (n = 2) ; ciprofloxacine (n = 1) ; et streptomycine (n = 5). La plupart des résultats non sensibles provenaient de la méthode BMD plutôt que de l’Etest (Fig. 1).

La meilleure façon de comparer les deux méthodes est d’analyser la concordance essentielle (les pourcentages de CMI à ± 1 log2 de dilution pour les deux méthodes ). L’accord essentiel pour tous les sites combinés (y compris les CMI hors échelle) était ≥90% pour la ciprofloxacine, la doxycycline, la lévofloxacine, la streptomycine et la tétracycline. Les valeurs de concordance essentielle pour la gentamicine, le triméthoprime-sulfaméthoxazole et le chloramphénicol étaient plus faibles, à 88 %, 78 % et 35 %, respectivement. Sauf pour le chloramphénicol et le triméthoprime-sulfaméthoxazole, il y avait généralement peu ou pas de variation dans la concordance essentielle entre les sites pour chaque médicament (tableau 3). Pour le chloramphénicol et le triméthoprime-sulfaméthoxazole, la concordance essentielle entre les méthodes de CMI dans les différents sites variait de 4 % à 81 % et de 58 % à 96 %, respectivement.

Les CMI Etest de la gentamicine et de la doxycycline étaient significativement (P = 0.03) plus élevées que les CMI BMD correspondantes (tableau 2) ; toutefois, les valeurs de la concordance essentielle entre les méthodes pour chaque médicament étaient encore bonnes, soit 88 % et 93 %, respectivement (tableau 2). Les CMI Etest du chloramphénicol, de la ciprofloxacine et du triméthoprime-sulfaméthoxazole étaient, en moyenne, significativement (P < 0,001) inférieures à leurs CMI BMD correspondantes, et seule la ciprofloxacine présentait une concordance essentielle ≥90 %. Pour la lévofloxacine, la streptomycine et la tétracycline, aucune différence statistique n’a été observée entre les CMI Etest et BMD.

Pour la diffusion sur disque, tous les disques antimicrobiens, à l’exception des disques de streptomycine, ont produit des zones de grand diamètre ; certaines zones dépassaient 40 à 50 mm de diamètre (tableau 4) et se chevauchaient les unes les autres sur la plaque MHA. Les marges des zones pour les médicaments produisant ces grandes zones étaient souvent floues ou indistinctes. Deux isolats d’un site d’essai présentaient des zones illisibles pour tous les médicaments en raison d’une faible croissance après 24 heures. Les disques de chloramphénicol et de triméthoprime-sulfaméthoxazole ont parfois produit un effet de double zone avec une marge intérieure de croissance plus claire, peut-être en raison de l’activité statique du médicament avec cet organisme à croissance lente. Les disques de streptomycine ont produit la taille moyenne de la zone d’inhibition la plus faible (23 à 24 mm de diamètre) et les zones les plus distinctes et lisibles. La taille des zones des autres types de disques était en moyenne de 30 à 42 mm de diamètre à 48 h, et leurs diamètres étaient plus difficiles à lire.

En général, il y avait une bonne concordance essentielle entre la méthode Etest et la méthode de référence BMD pour les antibiogrammes. Cependant, les taux de concordance essentielle entre l’Etest et le BMD pour le chloramphénicol, la gentamicine et le triméthoprime-sulfaméthoxazole étaient inférieurs au minimum de 90 % qui est recommandé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour l’utilisation d’une nouvelle méthode dans les tests cliniques (http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm071462.pdf).

Les différences d’intensité d’éclairage dans l’enceinte de sécurité biologique de chaque site de test peuvent être un facteur contribuant à la détermination du point final. Nous avons constaté que la lecture d’un point final d’Etest est plus facile lorsqu’une lampe de lecture est placée dans l’armoire pour compléter la source de lumière. Tous les sites, sauf le site D, ont utilisé cette source de lumière supplémentaire pour améliorer la lisibilité des tests de sensibilité. Les Etests de la tétracycline et de la doxycycline, comme ceux du chloramphénicol et du triméthoprime-sulfaméthoxazole, ont également été lus à un point final de 80 %, mais aucune double ellipse n’était perceptible et la concordance essentielle était ≥90 % pour les deux médicaments de la classe des tétracyclines, il semble donc que ce phénomène d’Etest varie selon la classe de médicaments pour Y. pestis.

Pour la gentamicine, la concordance essentielle globale était de 88 %, juste en dessous du seuil de concordance recommandé de 90 %. Deux sites ont démontré un accord essentiel élevé (96%), mais l’accord était plus faible (77% et 81%) pour les deux autres sites. La raison de cette variabilité est inconnue. Cependant, les distributions globales des CMI de l’Etest et de la DMO sont similaires (Fig. 1). Il a été suggéré que, pour les nouvelles méthodes d’antibiogramme réalisées avec des organismes à croissance lente ou fastidieux, les tests devraient être moins rigides par rapport à cette norme et qu’une concordance essentielle plus faible est acceptable (14). Cette logique semble appropriée pour l’Etest de la gentamicine, puisque la concordance essentielle était de 88 %. L’acceptabilité de l’Etest triméthoprime-sulfaméthoxazole à 78% d’accord essentiel n’est pas claire.

Une limitation de cette étude était qu’aucun isolat avec une résistance connue n’a été inclus. L’accès aux souches résistantes aux médicaments de Madagascar (3, 9-11) est restreint. D’autres rapports de résistance aux médicaments chez Y. pestis sont rares, et les souches résistantes ne sont pas bien caractérisées (15, 16, 24). Par conséquent, nous n’avons pas pu évaluer la capacité de la méthode Etest à détecter une résistance connue chez Y. pestis.

La méthode de diffusion sur disque n’est pas recommandée pour Y. pestis en raison de la difficulté à lire les zones d’inhibition mal définies et les grands diamètres de zone rencontrés avec la plupart des médicaments testés. Le test sur disque de streptomycine pourrait justifier une étude plus approfondie si des isolats résistants à la streptomycine deviennent accessibles, car les tailles de zone étaient plus petites et plus distinctes que celles obtenues avec d’autres disques.

En résumé, dans une comparaison de deux méthodes de CMI pour l’antibiogramme de Y. pestis, les résultats pour tous les agents antimicrobiens étaient bien corrélés entre Etest et BMD, sauf pour le chloramphénicol et le triméthoprime-sulfaméthoxazole, pour lesquels les points finaux étaient difficiles à déterminer par Etest. On a également constaté une plus grande variabilité d’un site à l’autre pour le chloramphénicol et le triméthoprime-sulfaméthoxazole que pour les autres médicaments. La méthode Etest semble être une alternative acceptable à la DMO pour la ciprofloxacine, la doxycycline, la gentamicine, la lévofloxacine, la streptomycine et la tétracycline, mais pas pour le chloramphénicol et le triméthoprime-sulfaméthoxazole. Comme Y. pestis se développe lentement sur la MHA, une incubation de 48 h est recommandée pour l’Etest. Cependant, comme nous n’avons pas pu inclure de souches de Y. pestis résistantes aux médicaments dans notre étude, il est également recommandé que les CMI Etest non sensibles soient confirmées par un test BMD de référence. Nous conseillons également de réaliser un test BMD de confirmation sur tout isolat de Y. pestis présentant une CMI Etest de 0,25 μg/ml pour la ciprofloxacine ou la lévofloxacine, une CMI située à l’extrémité supérieure de la plage de sensibilité, car on ne sait pas si une résistance émergente peut être détectée pour ces deux médicaments par la méthode Etest.