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Yersinia pestis ist der Erreger der Pest und kann als biologische Waffe eingesetzt werden (1, 13, 17-20, 23). Aus diesem Grund ist es wichtig, dass neu auftretende Arzneimittelresistenzen, seien sie nun natürlich oder künstlich erzeugt, mit standardisierten Methoden nachgewiesen werden können, die in mehreren Labors leicht anzuwenden sind. Das Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) beschreibt eine Referenzmethode für die Brühe-Mikrodilution (BMD) zur Prüfung der Empfindlichkeit von Y. pestis gegenüber antimikrobiellen Mitteln und bietet Richtlinien zur Interpretation der MHK für acht antimikrobielle Mittel (6). Die BMD verwendet eine kationenangepasste Mueller-Hinton-Bouillon (CAMHB) und erfordert eine 24-stündige Bebrütung bei 35 °C mit einer Option für eine 48-stündige Bebrütung, wenn das Wachstum nach 24 Stunden für die Interpretation der Endpunkte nicht ausreicht. Leider lässt sich die Referenz-BMD in vielen Labors nur schwer einführen, da sie relativ kostspielig und aufwändig ist und die Lagerung von Panels in gefrorenem oder dehydriertem Format erfordert. Es gibt mehrere alternative Methoden zur Empfindlichkeitsprüfung, darunter die Scheibendiffusions- und die Etest-Methode. Bevor diese Methoden jedoch für eine Spezies eingesetzt werden können, müssen sie bewertet und mit der BMD verglichen werden, um Korrelationen zwischen den Ergebnissen zu ermitteln, die durch Vergleiche der Methoden erzielt werden.

Y. pestis-Isolate sind anspruchsvoll und können auf künstlichen Medien langsamer wachsen als andere gängige Enterobacteriaceae-Spezies, weshalb es schwierig war, Methoden zur Empfindlichkeitsprüfung für Y. pestis zu standardisieren. In der Literatur werden mehrere Methoden beschrieben. Diskusdiffusionstests wurden in der Regel auf Mueller-Hinton-Agar (MHA) durchgeführt, wobei in der Regel eine 48-stündige Inkubation bei 35 °C erforderlich war, aber die methodischen Beschreibungen sind manchmal nicht sehr detailliert (10, 16, 24). Die Etest-Methode wurde von Wong et al. (25) unter Verwendung von MHA mit 5 % Schafsblut, Bebrütung bei 35 °C und einem Inokulum, das einer Nr. 1 McFarland anstelle des 0,5 McFarland-Standards, der in den meisten Scheiben- oder Etest-Diffusionsstudien verwendet wird. Die Agarverdünnung unter Verwendung von MHA, das 48 Stunden lang bei 27° bis 30°C inkubiert wird, ist die in der Literatur am häufigsten beschriebene Methode (7, 8, 11, 12, 22). Broth-Makrodilutions- und Mikrodilutionsmethoden wurden ebenfalls mit verschiedenen Inkubationstemperaturen verwendet (2, 21).

Es gibt mehrere Eigenschaften der Scheibendiffusions- und Etest-Methoden, die sie zu attraktiven alternativen Methoden für Empfindlichkeitstests machen, einschließlich der einfachen Lagerung und der langen Haltbarkeit der Scheiben und Streifen. Außerdem handelt es sich um agarbasierte Methoden, und die Endpunkte können leichter abzulesen sein als bei der BMD. Der Etest hat den zusätzlichen Vorteil, dass er ein MHK-Ergebnis liefert. In diesem Bericht werden die Ergebnisse einer multizentrischen Studie vorgestellt, in der Etest- und Scheibendiffusionsmethoden mit der CLSI-Referenzmethode BMD für die Empfindlichkeitsprüfung von Y. pestis verglichen wurden.

(Dieser Bericht wurde teilweise auf der 107. Generalversammlung der American Society for Microbiology, Toronto, Kanada, vom 21. bis 25. Mai 2007 vorgestellt.)

Sechsundzwanzig verschiedene Y.-pestis-Stämme aus den Sammlungen der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) und des U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) wurden sowohl mit der Etest- als auch mit der BMD-Methode an vier Prüfstellen und zusätzlich mit der Scheibendiffusion an zwei dieser Stellen getestet. Sechs Stämme gehörten zu Biovar Antiqua, sieben zu Biovar Medievalis und 12 zu Biovar Orientalis; ein atypisches Isolat konnte keiner Biovar zugeordnet werden. Die antimikrobiellen Wirkstoffe wurden sowohl mit BMD als auch mit Etest (bioMérieux, Durham, NC) getestet, und die entsprechenden Bereiche waren für BMD bzw. Etest wie folgt: für Chloramphenicol 0,03 bis 64 μg/ml und 0,016 bis 256 μg/ml; für Ciprofloxacin 0,03 bis 64 μg/ml und 0,002 bis 32 μg/ml; für Doxycyclin 0,03 bis 64 μg/ml und 0.016 bis 256 μg/ml; für Gentamicin, 0,03 bis 64 μg/ml und 0,016 bis 256 μg/ml; für Levofloxacin, 0,06 bis 64 μg/ml und 0,002 bis 32 μg/ml; für Streptomycin, 0,03 bis 64 μg/ml und 0.016 bis 256 μg/ml; für Tetracyclin 0,03 bis 64 μg/ml und 0,016 bis 256 μg/ml; und für Trimethoprim-Sulfamethoxazol 0,015/32 bis 16/304 μg/ml und 0,002/0,038 bis 32/608 μg/ml. Da die Bereiche für die BMD-Tests einiger Arzneimittel nicht die niedrigeren, mit dem Etest erreichbaren Konzentrationen umfassten, wurde die wesentliche Übereinstimmung (± 1 log2-Verdünnung) zwischen den Methoden bei einigen Ergebnisvergleichen als außerhalb der Skala liegend betrachtet (z. B. eine BMD-MHK für Levofloxacin von ≤0,06 μg/ml und eine Etest-MHK von 0,03 μg/ml). Im CDC wurden 96-Well-MIC-Tabletts mit 100 μl CAMHB (BBL, Sparks, MD) pro Vertiefung hergestellt; die Tabletts wurden bei -70 °C eingefroren und an die teilnehmenden Labors versandt. Die Tests wurden nach den CLSI-Standardmethoden für BMD und Scheibendiffusion durchgeführt (4-6). Die Inokula wurden aus 18- bis 24-stündigen aeroben Kulturen hergestellt, die auf 5%igen Schafsblutagarplatten (BBL) nach der Methode der direkten Koloniesuspension in Mueller-Hinton-Bouillon (MHB) (Remel, Lenexa, KS) gezüchtet wurden, um einem 0,5 McFarland-Trübungsstandard zu entsprechen (4); dieselben Inokula wurden zur Beimpfung von MHA-Platten mit einem Durchmesser von 150 mm für Etest und Scheibendiffusionstests verwendet. Unmittelbar nach der Inokulation wurden an jeder Teststelle mindestens zwei zufällige Koloniezählungen mit der positiven BMD-Wachstumskontrolle durchgeführt, um die Größe des Inokulums zu beurteilen. Es wurden nicht mehr als vier Etest-Streifen auf eine Platte aufgebracht. Für die Scheibendiffusion wurden handelsübliche Scheiben (BBL) mit einem selbststopfenden Multidisk-Dispenser (BBL) aufgetragen. BMD-Panels und MHA-Platten wurden sowohl für den Etest als auch für die Scheibendiffusion bei 35 °C bebrütet und nach 24 und 48 Stunden abgelesen. Die Ablesung der Tests erfolgte gemäß der Etest-Packungsbeilage wie folgt: Chloramphenicol, Doxycyclin, Tetracyclin und Trimethoprim-Sulfamethoxazol wurden bei 80 % Hemmung für den Schnittpunkt abgelesen; Ciprofloxacin, Levofloxacin, Gentamicin und Streptomycin wurden bei 100 % Hemmung abgelesen. Für die Datenanalyse wurden die Etest-MHKs auf die nächstliegende log2-Verdünnung aufgerundet. Escherichia coli ATCC 25922 und Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 wurden für die BMD- und Etest-Qualitätskontrolle verwendet. Die MHKs für die Qualitätskontrollstämme wurden durch 16- bis 20-stündige Inkubation bestimmt. Annehmbare BMD-Qualitätskontrollbereiche für Streptomycin wurden zuvor von der CDC festgelegt (unveröffentlichte Daten). Die Qualitätskontrolle des Chloramphenicol-Etests wurde durch Testen von Escherichia coli ATCC 25922 und Anwendung des akzeptablen Bereichs für die CLSI BMD durchgeführt.

Um die Übereinstimmung zwischen den Etest- und BMD-Ergebnissen zu messen, wurde die Verteilung der Unterschiede in den log2-Verdünnungs-MHKs untersucht und der Prozentsatz der MHK-Bestimmungen, die identische Werte ergaben (wesentliche Übereinstimmung innerhalb der Genauigkeitsgrenzen der Referenzmethode), für jedes Medikament berechnet. Um festzustellen, ob die Etest-Methode signifikant niedrigere oder höhere MHK-Werte als die Referenzmethode erbrachte, führten wir einen Wilcoxon-Signed-Rank-Test mit den MHK-Werten der beiden Tests in log2-Verdünnung unter Verwendung der statistischen Software SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC) durch; MHK-Werte innerhalb von ± 1 log2-Verdünnung wurden bei diesem Test als identisch angesehen. Der Vergleich der Ergebnisse der Interpretationskategorien (empfänglich, intermediär und resistent) erfolgte durch die Berechnung der Raten der geringfügigen, schwerwiegenden und sehr schwerwiegenden Fehler.

Im Allgemeinen waren die MHK-Endpunkte mit dem BMD leichter zu erkennen als mit dem Etest nach 24 Stunden (Daten nicht gezeigt). An drei Teststandorten (A, B und C) waren fast alle BMD- und Etest-MHKs nach 24 Stunden Inkubation ablesbar; ein einziges Etest-Ergebnis war die Ausnahme. An Standort D waren die BMD-MHKs nach 24 Stunden für alle außer einem Stamm ablesbar. Bei acht Stämmen an Standort D war das Wachstum unzureichend, um 24-Stunden-MHKs für Etest abzulesen. Die Anzahl der Etest-MHKs, die aufgrund von unzureichendem Wachstum nach 24 Stunden nicht ablesbar waren, war wie folgt: für Chloramphenicol, n = 6; für Ciprofloxacin, n = 4; für Doxycyclin, n = 3; für Gentamicin, n = 2; für Levofloxacin, n = 5; für Streptomycin, n = 5; für Tetracyclin, n = 4; und für Trimethoprim-Sulfamethoxazol, n = 4. In allen Prüfstellen konnten alle Ergebnisse nach 48 Stunden abgelesen werden, so dass die 48-Stunden-Ergebnisse für den Vergleich herangezogen wurden. Die Koloniezählungen zeigten, dass die Inokulumdichten in den BMD-Vertiefungen für alle vier Prüfstellen innerhalb akzeptabler Grenzen lagen; die Durchschnittswerte für die Prüfstellen reichten von 1,1 × 105 KBE/ml bis 4,2 × 105 KBE/ml.

Die MHK90 und der MHK-Bereich für jedes antimikrobielle Mittel wurden nach Methode verglichen (Tabelle 1). Bei allen Arzneimitteln außer Chloramphenicol waren die MHK90 für alle Methoden gleich oder lagen innerhalb von ± 1 log2 Verdünnung voneinander. Die Kategorieübereinstimmung zwischen den Etest- und BMD-Methoden war bei allen Arzneimitteln mit 97 % bis 100 % ausgezeichnet; alle Fehler waren geringfügig (Tabelle 1). Alle BMD- und Etest-MHKs lagen nach 24 Stunden Inkubation im empfänglichen Bereich (Daten nicht gezeigt). Nach 48 Stunden lagen die meisten MHKs im empfänglichen Bereich, mit Ausnahme der folgenden nicht-empfänglichen Ergebnisse: Chloramphenicol (n = 2), Ciprofloxacin (n = 1) und Streptomycin (n = 5). Die meisten unempfindlichen Ergebnisse stammten aus der BMD-Methode und nicht aus dem Etest (Abb. 1).

Die beiden Methoden lassen sich am besten vergleichen, indem man die wesentliche Übereinstimmung analysiert (der Prozentsatz der MHK-Werte innerhalb von ± 1 log2 Verdünnung für die beiden Methoden). Die wesentliche Übereinstimmung für alle Standorte zusammen (einschließlich der MHKs außerhalb der Skala) betrug ≥90 % für Ciprofloxacin, Doxycyclin, Levofloxacin, Streptomycin und Tetracyclin. Die Werte für die wesentliche Übereinstimmung bei Gentamicin, Trimethoprim-Sulfamethoxazol und Chloramphenicol lagen mit 88 %, 78 % bzw. 35 % niedriger. Mit Ausnahme von Chloramphenicol und Trimethoprim-Sulfamethoxazol gab es bei den einzelnen Arzneimitteln im Allgemeinen nur geringe oder gar keine Unterschiede in der wesentlichen Übereinstimmung zwischen den Standorten (Tabelle 3). Bei Chloramphenicol und Trimethoprim-Sulfamethoxazol reichte die wesentliche Übereinstimmung zwischen den MHK-Methoden an den einzelnen Standorten von 4 % bis 81 % bzw. von 58 % bis 96 %.

Die MHKs von Gentamicin und Doxycyclin im Etest waren signifikant (P = 0.03) höher als die entsprechenden BMD-MHKs (Tabelle 2); die Werte für die wesentliche Übereinstimmung zwischen den Methoden für jedes Medikament waren jedoch mit 88 % bzw. 93 % immer noch gut (Tabelle 2). Die MHKs von Chloramphenicol, Ciprofloxacin und Trimethoprim-Sulfamethoxazol im Etest waren im Durchschnitt signifikant (P < 0,001) niedriger als die entsprechenden BMD-MHKs, und nur Ciprofloxacin wies eine wesentliche Übereinstimmung von ≥90% auf. Für Levofloxacin, Streptomycin und Tetracyclin wurden keine statistischen Unterschiede zwischen den Etest- und BMD-MHKs festgestellt.

Bei der Scheibendiffusion erzeugten alle antimikrobiellen Scheiben mit Ausnahme der Streptomycin-Scheiben Zonen mit großem Durchmesser; einige Zonen hatten einen Durchmesser von mehr als 40 bis 50 mm (Tabelle 4) und überlappten sich auf der MHA-Platte gegenseitig. Die Zonenränder der Arzneimittel, die diese großen Zonen erzeugten, waren oft unscharf oder undeutlich. Zwei Isolate an einem Teststandort wiesen aufgrund von schlechtem Wachstum nach 24 Stunden für alle Arzneimittel unlesbare Zonen auf. Chloramphenicol- und Trimethoprim-Sulfamethoxazol-Platten erzeugten gelegentlich einen Doppelzoneneffekt mit einem helleren inneren Wachstumsrand, was möglicherweise auf die statische Aktivität des Arzneimittels bei diesem langsam wachsenden Organismus zurückzuführen ist. Streptomycin-Scheiben ergaben die geringste durchschnittliche Hemmhofgröße (23 bis 24 mm Durchmesser) und die deutlichsten, ablesbaren Zonen. Die Zonengrößen der anderen Scheibentypen betrugen nach 48 Stunden durchschnittlich 30 bis 42 mm im Durchmesser, und ihre Durchmesser waren schwieriger abzulesen.

Im Allgemeinen gab es eine gute grundlegende Übereinstimmung zwischen der Etest-Methode und der BMD-Referenzmethode für antimikrobielle Empfindlichkeitstests. Allerdings lagen die wesentlichen Übereinstimmungsraten zwischen Etest und BMD für Chloramphenicol, Gentamicin und Trimethoprim-Sulfamethoxazol unter dem Mindestwert von 90 %, der von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) für die Verwendung einer neuen Methode bei klinischen Tests empfohlen wird (http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm071462.pdf).

Unterschiede in der Beleuchtungsintensität in der biologischen Sicherheitswerkbank an den einzelnen Teststandorten können einen Einfluss auf die Endpunktbestimmung haben. Wir haben festgestellt, dass das Ablesen eines Etest-Endpunkts einfacher ist, wenn eine Leselampe in der Kabine angebracht ist, um die Lichtquelle zu ergänzen. Alle Standorte außer Standort D nutzten diese zusätzliche Lichtquelle, um die Ablesbarkeit der Empfindlichkeitstests zu verbessern. Tetracyclin- und Doxycyclin-Etests wurden ebenso wie die von Chloramphenicol und Trimethoprim-Sulfamethoxazol bei einem Endpunkt von 80 % abgelesen, aber es waren keine doppelten Ellipsen zu erkennen, und die wesentliche Übereinstimmung lag bei beiden Tetracyclin-Arzneimitteln bei ≥90 %, so dass das Phänomen des Etests bei Y. pestis offenbar je nach Arzneimittelklasse variiert.

Bei Gentamicin lag die wesentliche Übereinstimmung insgesamt bei 88 % und damit knapp unter dem empfohlenen Grenzwert von 90 %. Zwei Standorte wiesen eine hohe (96 %) wesentliche Übereinstimmung auf, aber die Übereinstimmung war bei den anderen beiden Standorten geringer (77 % und 81 %). Der Grund für diese Schwankungen ist unbekannt. Die Gesamtverteilungen der MHKs von Etest und BMD sind jedoch ähnlich (Abb. 1). Es wurde vorgeschlagen, dass für neue Empfindlichkeitsmethoden, die mit langsam wachsenden oder anspruchsvollen Organismen durchgeführt werden, die Tests weniger streng an diesen Standard gehalten werden sollten und dass eine geringere wesentliche Übereinstimmung zulässig ist (14). Diese Logik scheint für den Gentamicin Etest angemessen zu sein, da die wesentliche Übereinstimmung 88 % betrug. Die Annehmbarkeit des Trimethoprim-Sulfamethoxazol-Tests mit 78 % wesentlicher Übereinstimmung ist unklar.

Eine Einschränkung dieser Studie bestand darin, dass keine Isolate mit bekannter Resistenz einbezogen wurden. Der Zugang zu den arzneimittelresistenten Stämmen aus Madagaskar (3, 9-11) ist eingeschränkt. Andere Berichte über Arzneimittelresistenz bei Y. pestis sind selten, und resistente Stämme sind nicht gut charakterisiert (15, 16, 24). Daher konnten wir die Fähigkeit der Etest-Methode, bekannte Resistenzen bei Y. pestis nachzuweisen, nicht bewerten.

Die Scheibendiffusionsmethode wird für Y. pestis nicht empfohlen, da die schlecht definierten Hemmzonen und die großen Zonendurchmesser, die bei den meisten getesteten Arzneimitteln auftreten, schwer zu erkennen sind. Der Streptomycin-Scheibentest könnte eine weitere Untersuchung rechtfertigen, wenn streptomycinresistente Isolate zugänglich werden, da die Zonengrößen kleiner und deutlicher waren als die, die mit anderen Scheiben erhalten wurden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei einem Vergleich zweier MHK-Methoden für die Empfindlichkeitsprüfung von Y. pestis die Ergebnisse für alle antimikrobiellen Wirkstoffe zwischen Etest und BMD gut korrelierten, mit Ausnahme von Chloramphenicol und Trimethoprim-Sulfamethoxazol, für die die Endpunkte mit Etest schwer zu bestimmen waren. Bei Chloramphenicol und Trimethoprim-Sulfamethoxazol war auch die Variabilität von Ort zu Ort größer als bei den anderen Medikamenten. Die Etest-Methode scheint für Ciprofloxacin, Doxycyclin, Gentamicin, Levofloxacin, Streptomycin und Tetracyclin eine akzeptable Alternative zur BMD zu sein, nicht jedoch für Chloramphenicol und Trimethoprim-Sulfamethoxazol. Da Y. pestis auf MHA nur langsam wächst, wird für den Etest eine Bebrütung von 48 Stunden empfohlen. Da wir jedoch keine arzneimittelresistenten Y.-pestis-Stämme in unsere Studie einbeziehen konnten, wird auch empfohlen, die MHK-Werte von nicht-empfänglichen Etest durch einen BMD-Referenztest zu bestätigen. Wir raten außerdem dazu, bei jedem Y. pestis-Isolat mit einer Ciprofloxacin- oder Levofloxacin-Etest-MHK von 0,25 μg/ml, einer MHK am oberen Ende des empfindlichen Bereichs, einen bestätigenden BMD-Test durchzuführen, da nicht bekannt ist, ob eine aufkommende Resistenz für diese beiden Arzneimittel mit der Etest-Methode nachgewiesen werden kann.