TEXT

Yersinia pestis er det ætiologiske agens for pest og har potentiale til brug som biologisk våben (1, 13, 17-20, 23). På grund af dette er det vigtigt, at ny fremvoksende lægemiddelresistens, hvad enten den er naturlig eller konstrueret, kan påvises ved hjælp af standardiserede metoder, der let kan gennemføres i flere laboratorier. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) beskriver en referencemetode med bouillonmikrodilution (BMD) til testning af antimikrobiel modtagelighed for Y. pestis og giver retningslinjer for fortolkning af MIC for otte antimikrobielle stoffer (6). BMD anvender kationjusteret Mueller-Hinton-bouillon (CAMHB) og kræver inkubation ved 35 °C i 24 timer med mulighed for inkubation i 48 timer, når væksten efter 24 timer ikke er tilstrækkelig til at fortolke slutpunktet. Desværre er det vanskeligt at indføre reference-BMD i mange laboratorier, fordi det er relativt dyrt og besværligt og kræver opbevaring af paneler i frosset eller dehydreret format. Der findes flere alternative modtagelighedstestmetoder, herunder diskdiffusions- og Etest-metoder. Før disse metoder kan anvendes til en art, skal de imidlertid evalueres og sammenlignes med BMD for at bestemme korrelationer mellem de resultater, der opnås ved sammenligning af metoderne.

Y. pestis-isolater er fastidiøse og kan vokse langsommere på kunstige medier end andre almindelige arter af Enterobacteriaceae, og derfor har det været vanskeligt at standardisere modtagelighedstestmetoder for Y. pestis. Der er beskrevet flere metoder i litteraturen. Diskdiffusionstestning er generelt blevet udført på Mueller-Hinton agar (MHA), typisk med 48 timers inkubation ved 35 °C, men metodebeskrivelserne er undertiden mangelfulde i detaljer (10, 16, 24). Etest-metoden blev anvendt af Wong et al. (25) ved hjælp af MHA med 5% fåreblod, inkubation ved 35°C og et inokulum svarende til et nr. 1 McFarland-standard i stedet for den 0,5 McFarland-standard, der anvendes i de fleste disk- eller Etest-diffusionsundersøgelser. Agarfortynding med MHA, der er inkuberet ved 27-30 °C i 48 timer, er den mest almindelige metode, der er beskrevet i litteraturen (7, 8, 11, 12, 12, 22). Makrodilutions- og mikrodilutionsmetoder i bouillon er også blevet anvendt med forskellige inkubationstemperaturer (2, 21).

Der er flere egenskaber ved diskdiffusions- og Etest-metoder, der gør dem til attraktive alternative metoder til modtagelighedstest, herunder nem opbevaring og lang holdbarhed for diske og strimler. Det er også agar-baserede metoder, og slutpunkterne kan være lettere at aflæse end BMD-metoderne. Etest har den ekstra fordel, at den giver et MIC-resultat. I denne rapport præsenterer vi resultaterne af en multicenterundersøgelse, der sammenligner Etest- og diskdiffusionsmetoder med CLSI-referencemetoden BMD til modtagelighedstestning af Y. pestis.

(Denne rapport blev delvist præsenteret på 107th General Meeting of the American Society for Microbiology, Toronto, Canada, 21. til 25. maj 2007.)

Twenty-six forskellige Y. pestis-stammer fra Centers for Disease Control and Prevention (CDC) og U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) samlinger blev testet ved både Etest- og BMD-metoden på fire teststeder og desuden ved diskdiffusion på to af disse steder. Seks stammer var biovar Antiqua, syv var biovar Medievalis, og 12 var biovar Orientalis; et atypisk isolat kunne ikke henføres til nogen biovar. De antimikrobielle stoffer blev testet med både BMD og Etest (bioMérieux, Durham, NC), og deres tilsvarende intervaller var som følger for henholdsvis BMD og Etest: for chloramphenicol, 0,03 til 64 μg/ml og 0,016 til 256 μg/ml; for ciprofloxacin, 0,03 til 64 μg/ml og 0,002 til 32 μg/ml; for doxycyclin, 0,03 til 64 μg/ml og 0,002 til 32 μg/ml; for doxycyclin, 0,03 til 64 μg/ml og 0,016 til 256 μg/ml; for ciprofloxacin, 0,03 til 64 μg/ml og 0,002 til 32 μg/ml.016 til 256 μg/ml; for gentamicin: 0,03 til 64 μg/ml og 0,016 til 256 μg/ml; for levofloxacin: 0,06 til 64 μg/ml og 0,002 til 32 μg/ml; for streptomycin: 0,03 til 64 μg/ml og 0,002 til 32 μg/ml; for streptomycin: 0,03 til 64 μg/ml og 0,002 til 32 μg/ml.016 til 256 μg/ml; for tetracyclin 0,03 til 64 μg/ml og 0,016 til 256 μg/ml; og for trimethoprim-sulfamethoxazol 0,015/32 til 16/304 μg/ml og 0,002/0,038 til 32/608 μg/ml. Da intervallerne for BMD-testning af nogle lægemidler ikke omfattede de lavere koncentrationer, der kan opnås med Etest, blev den væsentlige overensstemmelse (± 1 log2-fortynding) mellem metoderne betragtet som værende uden for skalaen for nogle resultatsammenligninger (f.eks. en BMD-levofloxacin-MIC på ≤0,06 μg/ml og en Etest-MIC på 0,03 μg/ml). På CDC blev der fremstillet 96 brønde MIC-brikker med 100 μl CAMHB (BBL, Sparks, MD) pr. brønd; brikkerne blev opbevaret frosset ved -70 °C og sendt til de deltagende laboratorier. Testen blev udført efter CLSI-standardmetoder for BMD og diskdiffusion (4-6). Inokula blev fremstillet af 18- til 24-timers aerobe kulturer dyrket på 5 % fåreblodagarplader (BBL) ved den direkte kolonisuspensionsmetode i Mueller-Hinton-bouillon (MHB) (Remel, Lenexa, KS), så de svarede til en 0,5 McFarland-standard for turbiditet (4); de samme inokula blev anvendt til inokulering af MHA-plader med en diameter på 150 mm til Etest- og diskdiffusionstest. Umiddelbart efter inokulationen blev der foretaget mindst to tilfældige kolonitællinger på hvert teststed med den positive BMD-vækstkontrolbrønd for at vurdere inokulumstørrelsen. Der blev ikke anvendt mere end fire Etest-strimler på en plade. Ved diskdiffusion blev der påført kommercielle diske (BBL) med en selvstøbende multidiskdispenser (BBL). BMD-paneler og MHA-plader til både Etest- og diskdiffusion blev inkuberet ved 35 °C og aflæst efter 24- og 48 timer. Etests blev aflæst som anvist i henhold til Etest-pakkeinlæggene som følger: Chloramphenicol, doxycyclin, tetracyclin og trimethoprim-sulfamethoxazol blev aflæst ved 80 % hæmning for intersektionspunktet; ciprofloxacin, levofloxacin, gentamicin og streptomycin blev aflæst ved 100 % hæmning. Ved dataanalyser blev Etest-MIC’erne afrundet opad til nærmeste log2-fortynding. Escherichia coli ATCC 25922 og Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 blev anvendt til BMD- og Etest-kvalitetskontrol. MIC’er for kvalitetskontrolstammer blev bestemt ved inkubation i 16-20 timer. Acceptable BMD-kvalitetskontrolintervaller for streptomycin er tidligere blevet fastlagt af CDC (upublicerede data). Kvalitetskontrol af chloramphenicol Etest blev udført ved at teste Escherichia coli ATCC 25922 og anvende det acceptable interval for CLSI BMD.

For at måle overensstemmelsen mellem Etest- og BMD-resultaterne blev fordelingen af forskelle i log2-fortyndings-MIC’erne undersøgt, og procentdelen af MIC-bestemmelser, der gav identiske værdier (væsentlig overensstemmelse inden for referencemetodens nøjagtighedsgrænser ), blev beregnet for hvert lægemiddel. For at fastslå, om Etest-metoden gav signifikant lavere eller højere MIC’er end referencemetoden, udførte vi også en Wilcoxon signed-rank-test med log2-udvandings-MIC’erne for de to tests ved hjælp af SAS-statistiksoftware (SAS Institute Inc., Cary, NC); MIC’er inden for ± 1 log2-udvanding blev betragtet som identiske for denne test. Sammenligning af fortolkningskategorieresultater (modtagelige, intermediære og resistente) blev foretaget ved at beregne satser for mindre, større og meget store fejl.

Generelt var MIC-endpunkterne lettere at skelne ved BMD end ved Etest efter 24 timer (data ikke vist). På tre teststeder (A, B og C) kunne næsten alle BMD- og Etest-MIC’er aflæses efter 24 timers inkubation; et enkelt Etest-resultat var en undtagelse. Sted D rapporterede læsbare BMD-MIC’er efter 24 timer for alle stammer undtagen én. Der var ikke tilstrækkelig vækst til at aflæse 24-h Etest-MIC’er for otte stammer på lokalitet D. Antallet af Etest-MIC’er, der ikke kunne aflæses på grund af utilstrækkelig vækst efter 24 timer efter lægemiddel, var som følger: for chloramphenicol n = 6, for ciprofloxacin n = 4, for doxycyclin n = 3, for gentamicin n = 2, for levofloxacin n = 5, for streptomycin n = 5, for tetracyclin n = 4 og for trimethoprim-sulfamethoxazol n = 4. Alle teststeder var i stand til at aflæse alle resultater efter 48 timer. Derfor blev resultaterne efter 48 timer anvendt i sammenligningen. Kolontællinger viste, at inokulumtæthederne i BMD-brøndene var inden for acceptable grænser for alle fire teststeder; gennemsnitsværdierne for stederne varierede fra 1,1 × 105 CFU/ml til 4,2 × 105 CFU/ml.

MIC90 og MIC-området for hvert antimikrobielt middel blev sammenlignet efter metode (tabel 1). For alle stoffer undtagen chloramphenicol var MIC90’erne for alle metoderne de samme eller inden for ± 1 log2 fortynding af hinanden. Kategorioverensstemmelsen mellem Etest- og BMD-metoderne for alle lægemidler var fremragende med 97 % til 100 %; alle fejl var mindre alvorlige (tabel 1). Alle BMD- og Etest-MIC’er var inden for det modtagelige område efter 24 timers inkubation (data ikke vist). Efter 48 timer var de fleste MIC’er inden for det modtagelige område med undtagelse af følgende ikke-modtagelige resultater: chloramphenicol (n = 2), ciprofloxacin (n = 1) og streptomycin (n = 5). De fleste af de ikke-modtagelige resultater var fra BMD-metoden snarere end Etest (fig. 1).

De to metoder sammenlignes bedst ved at analysere den essentielle overensstemmelse (procentdelen af MIC’er inden for ± 1 log2 fortynding for de to metoder ). Essentiel overensstemmelse for alle steder kombineret (herunder off-scale MIC’er) var ≥90 % for ciprofloxacin, doxycyclin, levofloxacin, levofloxacin, streptomycin og tetracyclin. Værdierne for essentiel overensstemmelse for gentamicin, trimethoprim-sulfamethoxazol og chloramphenicol var lavere, nemlig henholdsvis 88 %, 78 % og 35 %. Bortset fra chloramphenicol og trimethoprim-sulfamethoxazol var der generelt kun lidt eller ingen variation i den væsentlige overensstemmelse mellem stederne for hvert enkelt lægemiddel (tabel 3). For chloramphenicol og trimethoprim-sulfamethoxazol varierede den væsentlige overensstemmelse mellem MIC-metoderne på de enkelte steder fra henholdsvis 4 % til 81 % og fra 58 % til 96 %.

MIC’erne for gentamicin og doxycyclin Etest var signifikant (P = 0.03) højere end de tilsvarende BMD-MIC’er (tabel 2); værdierne for essentiel overensstemmelse mellem metoderne for hvert lægemiddel var dog stadig gode på henholdsvis 88 % og 93 % (tabel 2). Kloramfenicol, ciprofloxacin og trimethoprim-sulfamethoxazol Etest-MIC’er var i gennemsnit signifikant (P < 0,001) lavere end deres tilsvarende BMD-MIC’er, og kun ciprofloxacin havde en essentiel overensstemmelse på ≥90 %. For levofloxacin, streptomycin og tetracyklin blev der ikke set nogen statistiske forskelle mellem Etest- og BMD-MIC’er.

Ved diskdiffusion producerede alle antimikrobielle skiver undtagen streptomycinskiverne zoner med stor diameter; nogle zoner oversteg 40-50 mm i diameter (tabel 4) og overlappede hinanden på MHA-pladen. Zonegrænserne for lægemidler, der producerede disse store zoner, var ofte uklare eller utydelige. To isolater på et teststed havde ulæselige zoner for alle lægemidler på grund af dårlig vækst efter 24 timer. Kloramfenicol- og trimethoprim-sulfamethoxazol-plader producerede lejlighedsvis en dobbeltzoneeffekt med en lysere indre vækstrand, muligvis på grund af lægemidlets statiske aktivitet over for denne langsomt voksende organisme. Streptomycinskiverne gav den laveste (23-24 mm i diameter) gennemsnitlige hæmningszone og de mest tydelige, læsbare zoner. Zonestørrelser for de andre skivetyper var i gennemsnit 30 til 42 mm i diameter ved 48 timer, og deres diametre var vanskeligere at aflæse.

Generelt var der god væsentlig overensstemmelse mellem Etest-metoden og BMD-referencemetoden til antimikrobiel modtagelighedstest. Imidlertid var de væsentlige overensstemmelsesrater mellem Etest og BMD for chloramphenicol, gentamicin og trimethoprim-sulfamethoxazol lavere end de 90 % minimum, som anbefales af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) til brug af en ny metode i klinisk testning (http://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm071462.pdf).

Differencer i belysningsintensitet i det biologiske sikkerhedsskab på hvert teststed kan være en medvirkende faktor for bestemmelse af slutpunktet. Vi har fundet ud af, at det er lettere at aflæse et Etest-endepunkt, når der er placeret en læselampe i kabinettet som supplement til lyskilden. Alle steder undtagen sted D benyttede denne ekstra lyskilde for at forbedre læsbarheden af modtagelighedstestene. Tetracyclin- og doxycyclin-Etests blev ligesom dem for chloramphenicol og trimethoprim-sulfamethoxazol også aflæst ved et 80 % endepunkt, men der kunne ikke konstateres dobbelte ellipser, og den væsentlige overensstemmelse var ≥90 % for begge lægemidler i tetracyclinklassen, så det ser ud til, at dette Etest-fænomen varierer efter lægemiddelklasse for Y. pestis.

For gentamicin var den samlede væsentlige overensstemmelse 88 %, lige under den anbefalede grænseværdi for overensstemmelse på 90 %. To steder viste høj (96 %) essentiel overensstemmelse, men overensstemmelsen var lavere (77 % og 81 %) for de to andre steder. Årsagen til denne variabilitet er ukendt. De overordnede MIC-fordelinger for Etest- og BMD-MIC’er er imidlertid ens (fig. 1). Det er blevet foreslået, at for nye modtagelighedsmetoder, der udføres med langsomt voksende eller krævende organismer, bør testningen ikke holdes så strengt til denne standard, og at en lavere essentiel overensstemmelse er acceptabel (14). Denne logik synes at være hensigtsmæssig for gentamicin Etest, da den væsentlige overensstemmelse var 88 %. Acceptabiliteten af trimethoprim-sulfamethoxazol Etest med en essentiel overensstemmelse på 78 % er uklar.

En begrænsning i denne undersøgelse var, at der ikke blev medtaget isolater med kendt resistens. Adgangen til de lægemiddelresistente stammer fra Madagaskar (3, 9-11) er begrænset. Andre rapporter om lægemiddelresistens hos Y. pestis er sjældne, og resistente stammer er ikke velkarakteriseret (15, 16, 24). Derfor kunne vi ikke evaluere Etest-metodens evne til at påvise kendt resistens hos Y. pestis.

Diskdiffusionsmetoden anbefales ikke til Y. pestis på grund af vanskelighederne med at aflæse de dårligt definerede hæmningszoner og store zonediametre, som man støder på med de fleste af de testede lægemidler. Streptomycin-disc-testning kan berettige yderligere undersøgelse, hvis streptomycin-resistente isolater bliver tilgængelige, fordi zonestørrelserne var mindre og mere tydelige end dem, der blev opnået med andre diske.

I en sammenligning af to MIC-metoder til testning af Y. pestis’ modtagelighed korrelerede resultaterne for alle antimikrobielle midler godt mellem Etest og BMD undtagen for chloramphenicol og trimethoprim-sulfamethoxazol, for hvilke slutpunkterne var vanskelige at bestemme med Etest. Der var også større variabilitet fra sted til sted for chloramphenicol og trimethoprim-sulfamethoxazol end for de andre lægemidler. Etest-metoden synes at være et acceptabelt alternativ til BMD for ciprofloxacin, doxycyclin, gentamicin, levofloxacin, streptomycin og tetracyclin, men ikke for chloramphenicol og trimethoprim-sulfamethoxazol. Da Y. pestis vokser langsomt på MHA, anbefales 48 timers inkubation til Etest. Da vi imidlertid ikke var i stand til at medtage nogen lægemiddelresistente Y. pestis-stammer i vores undersøgelse, anbefales det også, at ikke-modtagelige Etest-MIC’er bekræftes ved hjælp af en BMD-MIC-referencetest. Vi anbefaler også, at der udføres bekræftende BMD-test på ethvert Y. pestis-isolat med en ciprofloxacin- eller levofloxacin-Etest-MIC på 0,25 μg/ml, en MIC i den høje ende af det modtagelige område, da det er ukendt, om der kan påvises begyndende resistens for disse to lægemidler ved hjælp af Etest-metoden.