- Abstract
- Indledning
- Mutagenisering af musens kimlinje
- Isolering af sygdomsmodeller ved hjælp af ENU
- Screens i stor skala
- Små screeninger i lille skala
- Kombination af gen- og fænotypedrevne tilgange
- Identificering af punktmutationer
- Screening for sygdomsfænotyper
- Generering af ressourcer til mutantmus
- Genetiske ressourcer
- Arkivering
- Databaser
- Distribution
- Fremtiden ser lys ud
- Anerkendelser
Abstract
Fremskridtene inden for sekventering af det menneskelige genom er drivkraften bag genetiske metoder til at definere genernes funktion. Strategier som f.eks. genfælder og kemisk mutagenese vil snart generere en stor mutantmusressource. Punktmutationer induceret af N -ethyl- N -nitrosourea (ENU) udgør en unik mutantressource, fordi de: (i) afspejler konsekvenserne af en enkelt genændring uafhængigt af positionseffekter, (ii) giver en finstrukturel dissektion af proteinfunktionen, (iii) viser en række mutanteffekter fra fuldstændigt eller delvist tab af funktion til overdreven funktion, og (iv) opdager genfunktioner på en uvildig måde. Fænotypedrevne ENU-screeninger i musen lægger vægt på relevans for kliniske sygdomme hos mennesker ved at fokusere på kardiologi, fysiologi, neurologi, immunitet, hæmatopoiese og pattedyrs udvikling. Sådanne metoder er ekstremt effektive til at forstå komplekse menneskelige sygdomme og træk: baseparforandringer kan nøjagtigt modellere baseforandringer, der findes i menneskelige sygdomme, og subtile mutantalleler i en standard genetisk baggrund giver mulighed for at analysere konsekvenserne af sammensatte genotyper. De igangværende ENU-mutageneseforsøg med mus genererer et skatkammer af nye mutationer, der gør det muligt at foretage en dybtgående undersøgelse af et enkelt gen, et kromosomområde eller et biologisk system.
Indledning
De manipulerende genetiske værktøjer i musen er omfattende og effektive. Musegenteknikere kan fjerne eller overeksprimere gener i hele dyret eller i et bestemt væv, indføre store stykker eget eller fremmed DNA i genomet og manipulere hele kromosomer. Disse teknikker kombineret med de genetiske, udviklingsmæssige, patologiske og fysiologiske ligheder mellem mus og mennesker har gjort laboratoriemusen til en primær modelorganisme for forskning i sygdomme hos mennesker. Indavlede musestammer giver mulighed for at studere et sygdomsegenskab på en defineret genetisk baggrund, hvilket gør det muligt at skelne mellem de fænotyper, der skyldes en enkelt mutation, og de bidrag, der kommer fra andre genetiske modifikatorer.
Evnen til at konstruere tab af funktionsmutationer ved homolog rekombination i embryonale stamceller var banebrydende for en revolution i musens biologi. Ved hjælp af embryonale stamcelleteknologi kan ethvert gen, der er involveret i sygdomme hos mennesker, forstyrres, hvilket giver værdifulde oplysninger om konsekvenserne af mutationer i hele dyret. Selv om nulmutationer er nødvendige, er subtile mutationer induceret af N -ethyl- N -nitrosourea (ENU) uvurderlige til undersøgelse af hele rækken af genfunktioner. Mutationer i kodningsområder og reguleringselementer kan give vidt forskellige fænotyper, samtidig med at de giver en finstruktureret dissektion af proteinfunktion og genregulering. Serier af alleler kan genereres ved homologe rekombination, men fænotypedrevet mutagenese giver mange fordele i form af hurtig generering og fjernelse af forskerbias. Derfor bør en knockout-database for musegenomet kun betragtes som et udgangspunkt; yderligere alleler og vævsspecificiteter er obligatoriske for at færdiggøre den funktionelle analyse.
Mutagenisering af musens kimlinje
ENU kan overføre sin ethylgruppe til ilt- eller kvælstofradikaler i DNA, hvilket resulterer i fejlparring og baseparsubstitution, hvis det ikke repareres. De højeste mutationsrater forekommer i præmeiotiske spermatogonale stamceller med en enkelt locus-mutationsfrekvens på 6–1,5 × 10 -3 ( 1-3 ), hvilket svarer til at opnå en mutation i et enkelt valgfrit gen i en ud af hver 175-655 screenede gameter. På grund af dets evne til at isolere mutationer i ethvert gen eller område af interesse er ENU blevet anvendt i musen til at: (i) at opnå multialleliske serier af enkelte gener for yderligere at definere funktionen; (ii) at dissekere biokemiske eller udviklingsmæssige veje; (iii) at opnå nye recessive mutationer på et enkelt kromosom eller på hele genomet; og (iv) at mætte regioner af musens genom, der ikke er dækket af deletioner ( 4-10 ). Analysen af 62 sekventerede germlinemutationer fra 24 gener viser, at ENU overvejende ændrer A/T-basepar med 44 % A/T→T/A-transversioner, 38 % A/T→G/C-overgange, 8 % G/C →A/T-overgange, 3 % G/C→C/G-transversioner, 5 % A/T→C/G-overgange og 2 % G/C→T/A-overgange ( Tabel 1 ; Fig. 1 ). Når de oversættes til et proteinprodukt, resulterer disse ændringer i 64 % missense-mutationer, 10 % nonsense-mutationer og 26 % splejsningfejl ( Tabel 1 ; Fig. 1 ).
Da ENU er et punktmutagen, kan det fremkalde mange forskellige typer alleler. Loss-of-function-mutationer, levedygtige hypomorfer af letale komplementationsgrupper, antimorfer og gain-of-function-mutationer er blevet isoleret i mutagenesescreeninger af mus ( 4 , 9-16 ). Serier af alleler på enkelte loci er ekstremt effektive, når de analyseres sammen for at definere funktionen. Alleliske serier på komplekse loci kan forstyrre individuelle proteinisoformer, hvilket fører til opdagelse af forskellige funktioner i forskellige væv i løbet af en organismes liv ( 17 ). Et slående eksempel på en sådan allelisk serie er locus quaking ( qk ). Før isoleringen af de ENU-inducerede alleler blev quaking-lokusset defineret af en enkelt spontan allel, qkV , med en homozygot fænotype med anfald og quaking forårsaget af alvorlig dysmyelinisering af centralnervesystemet (CNS) ( 18 ). De ENU-inducerede alleler afslører imidlertid, at quaking også fungerer under embryogenese ( 7 , 13 ). Homozygoter af fire af fem ENU-inducerede alleler ( qk1-1 , qkkt1 , qkk2 , qkkt3/4 ) dør på embryonaldage (E) 8,5-10,5 med CNS-defekter, mens kun én er levedygtig med kvælning og kramper ( qke5 ) (19; J.K. Noveroske og M.J. Justice, upublicerede data). Selv om quaking-allellerne kan grupperes på grundlag af embryonets letalitet eller levedygtig dysmyelinisering, afviger hver allel på en eller anden væsentlig måde fra disse generelle fænotyper, hvilket gør den til en unik og værdifuld ressource til finstruktur/funktionsundersøgelser og modellering af menneskelige neuralrørsdefekter samt krampeanfald og myeliniseringsforstyrrelser ( Tabel 2 ). Alleliske serier genereret ved ENU eller genmålretning på andre komplekse loci vil være værdifulde værktøjer til at dissekere proteinfunktion ( 17 ).
Sammenfatning af sekventerede ENU-inducerede mutationer
Sammenfatning af sekventerede ENU-inducerede mutationer
ENU-mutagenese til isolering af mutationer. ENU inducerer læsioner i DNA’et i stamceller fra muses spermatogoniale stamceller, der primært påvirker AT-baseparrene. Disse læsioner er til stede i hannens sædceller, og efter at de er blevet isoleret gennem genetiske og fænotypiske screeninger, giver de anledning til en række fænotypiske mutationer. De mutante proteinprodukter er primært missense-mutationer, som er en værdifuld mutationsklasse til at dissekere proteinstruktur og -funktion. Ved mutagenese i musen vil der blive lagt vægt på modellering af menneskelige sygdomme gennem fænotype-drevne assays.
ENU-mutagenese til isolering af mutationer. ENU inducerer læsioner i DNA’et i stamceller fra muses spermatogoniale stamceller, der primært påvirker AT-baseparrene. Disse læsioner er til stede i hannens sædceller, og efter at de er blevet isoleret gennem genetiske og fænotypiske screeninger, giver de anledning til en række fænotypiske mutationer. De mutante proteinprodukter er primært missense-mutationer, som er en værdifuld mutationsklasse til at dissekere proteinstruktur og -funktion. Ved mutagenese i musen vil der blive lagt vægt på modellering af menneskelige sygdomme gennem fænotype-drevne analyser.
Isolering af sygdomsmodeller ved hjælp af ENU
Differente genetiske screeninger kan anvendes til at isolere ENU-inducerede mutationer. En enkeltgenerations-screening kan hurtigt generere levedygtige og fertile mutanter, der repræsenterer allel-serier, modifikatorer eller dominerende mutationer. Deletionsscreens i to generationer kan identificere recessive letale mutationer i et defineret område af genomet. Tre-generations stamtræscreens kan anvendes til at scanne hele genomet for en levedygtig mutation af interesse eller, i kombination med forbundne markører eller balancer-kromosomer, til at isolere letale eller sterile alleler (se nedenfor).
Screens i stor skala
Der er allerede blevet finansieret flere mutagenesescreeninger i stor skala internationalt. De vigtigste træk ved disse screeninger er opsummeret i tabel 3 . Hver af disse screeninger anvender en anden genetisk strategi til at isolere mutationer: nogle screeninger er rettet mod dominerende mutationer, mens andre er designet til at isolere recessive mutationer. Nogle grupper screener for recessive dødelige og skadelige mutationer med regional mutagenese for at undersøge genfunktionen parallelt med Human Genome Project. Andre grupper scanner et stort antal mutageniserede genomer for dominerende neurologiske og kliniske hæmatologiske eller biokemiske varianter.
Små screeninger i lille skala
Screening for mutationer behøver ikke nødvendigvis at blive udført i stor skala. To omkostningseffektive strategier til det lille laboratorium er alleliske serier og sensibiliserede pathway-screeninger. En screeningsundersøgelse med sensibiliseret vejsøgning er rettet mod en enkelt biologisk eller biokemisk vejsøgning og udnytter ikke-allelisk ikke-komplementering til at isolere mutationer i første generations afkom af mutageniserede hanner. I en sådan screening kan en induceret mutation (*) på et locus, der interagerer med det pågældende locus ( m ), ikke komplementere (*/+;+/ m ), men alligevel give en fænotype, der minder om den oprindelige homozygote mutant ( m/m ). Nogle sensibiliserede screeninger kan udføres på baggrund af en lægemiddel- eller miljømodifikation i stedet for en genetisk modifikation. Ved hjælp af en phenylalanininjektion som sensibilisator blev der f.eks. isoleret en række mutationer, der påvirker phenylalaninmetabolismevejen, som heterozygoter ( 20 , 21 ).
Kombination af gen- og fænotypedrevne tilgange
En unik tilgang til isolering af mutationer kombinerer genbaseret målretning i embryonale stamceller med fænotypedrevet ENU-mutagenese. Kraftfulde genetiske strategier i Drosophila er afhængige af tilgængeligheden af genetiske reagenser som f.eks. deletioner, duplikationer og inversioner for at lette genetiske screeninger og give en enkel og omkostningseffektiv vedligeholdelse af bestanden. Deletioner er nyttige til at generere haploiditet i genetiske screeninger samt til kortlægning ved hjælp af ikke-komplementeringsstrategier ( Fig. 2 B) ( 22 ). Inversioner, der bærer en dominerende markør og er homozygote letale, er ideelle balancer-kromosomer til at undertrykke rekombination og let identificere klasser af afkom med henblik på isolering og vedligeholdelse af letale eller skadelige mutationer ( Fig. 2 C). Evnen til at konstruere hele kromosomområder ved hjælp af Cre /loxP-teknologier gør det muligt at skabe disse genetiske reagenser i en to-trins genmålretningsproces ( Fig. 2 A) ( 23 , 24 ). Tilgangen er genbaseret, fordi endepunkterne for deletionen eller inversionen er kendt, hvilket minimerer den indsats, der er nødvendig for at karakterisere omlægningerne. Tekniske teknikker gør det muligt at mærke omlægningerne med en dominerende gul pelsfarvemarkør, K-14 agouti , hvilket giver en ressource til simpel kortlægning, vedligeholdelse af bestanden og genetiske screeninger ( 22 , 24 , 25 ). Oprettelsen af genomiske musebiblioteker, der indeholder de konstruktioner, der er nødvendige for de målrettede hændelser, giver et hurtigt system til at generere dem overalt i musegenomet ( fig. 2 A) ( 25 ).
Særlige træk ved quaking alleler
Særlige træk ved quaking alleler
Funderede store-scale ENU screens
Funded large-scale ENU screens
En indledende mutageneseindsats, der er udformet med henblik på at isolere recessive mutationer i mange fænotypiske klasser, er rettet mod musekromosom 11, som er et genrigt kromosom, der i høj grad er konserveret med det menneskelige kromosom 17. Målet er at mætte kromosomet med mutationer for at definere genfunktionen og derefter bruge linkage conservation mellem musen og mennesket til at forudsige genfunktionen hos mennesket. Ved hjælp af de genetiske reagenser, der er genereret ved Cre /loxP-teknik, udføres der to mutageneseskemaer: togenerationsdeletionspedigrees ( fig. 2 B) og tregenerationspedigrees ved hjælp af balancerkromosomer ( fig. 2 C). Begge ordninger udnytter den gule pelsfarve, som K14-agouti-transgenet giver. Deletionsskemaet kan kun anvendes til store deletioner, der ikke er skadelige for dyret, hvilket begrænser screeningen til visse regioner, men gør det muligt at isolere mutationer på kun to generationer. Inversionsordningen gør det muligt at screene en større del af kromosomet for mutationer, men kræver tre generationers avl.
Identificering af punktmutationer
For at være værdifulde skal nye mutationer lokaliseres, således at kandidatgener og relevante menneskelige sygdomsmodeller kan identificeres. Punktmutationer, der er isoleret ud fra deres fænotype, skal kortlægges ved hjælp af fænotypeoplysninger, da et molekylært mærke ikke er tilgængeligt. Traditionelt kortlægges disse mutationer i meiotiske backcrosses, hvor fænotypen segregeres i forhold til flere molekylære polymorfismer (for en gennemgang, se ref. 26 ). For at kortlægge med en opløsning på 10 cM er det nødvendigt at analysere 100 meioser. 100 nye mutationer, der er isoleret i hele genomet, vil således kræve analyse af 10 000 mus. Kortlægningsstrategier med høj opløsning til positionskloning indebærer normalt en analyse af 1000-2000 meioser pr. mutation. Der kan isoleres et væld af dominerende og recessive mutationer i enhver ENU-screening, hvilket gør kortlægningen til flaskehalsen i processen og kræver enklere kortlægningsteknologier såsom DNA-pooling ( 27 ). De ovenfor beskrevne pelsfarve-markerede screeninger er unikke, idet mutationen er isoleret i forbindelse med synlige kromosomale markører, så dens kromosomale placering er kendt ved isolering, hvilket eliminerer behovet for meiotisk kortlægning. Endvidere kan de Cre /loxP-genererede deletioner anvendes til at lokalisere mutationerne til et subkromosomalt område ved ikke-komplementering ( 22 , 28 ). Da sekvensen af musegenomet snart vil være tilgængelig, vil mange mutationer blive tildelt gener på grundlag af positionel kandidatur efter deres lokalisering. Desuden kan BAC-komplementering anvendes til at identificere mutation-genkorrelationer ( 29 ).
( A ) Generering af kromosomomomomlægninger ved hjælp af Cre /loxP . Der er konstrueret to lambda-mus-genombiblioteker, som indeholder de selekterbare markører, der er nødvendige for totrins målretning af begivenheder. Det ene indeholder den selekterbare markør neomycin ( Neo ), 5′-enden af hypoxanthinphosphoribosyltransferase ( Hprt ), et loxP-sted og Tyrosinase-minigenet ( Ty ). Det andet bibliotek indeholder den selekterbare markør puromycin ( Puro ), 3′-enden af Hpr , et loxP-sted og K14-Agouti-transgenet ( Ag ). Hvis loxP-stederne er indsat i cis i samme retning, vil rekombination efter Cre-transfektion give en deletion og HAT-resistente, Puro-følsomme og Neo-følsomme ES-celler. Hvis loxP-stederne er indsat i modsat retning, vil rekombination efter Cre-transfektion resultere i en inversion med HAT-resistente, Puro-resistente, Neo-resistente ES-celler. (B og C) Mutageneseskemaer for musekromosom 11 ved hjælp af kromosomomale rearrangementer med gul pelsfarve. Deletionen eller inversionen er mærket med en dominerende gul pelsfarvemarkør, K-14-agouti (gul). Hvert skema anvender den dominerende Rex ( Re , og angivet ved det sorte kromosom) mutation på Chr 11, som forårsager krøllet pels (meleret). I hvert skema injiceres wild-type hanner (C57BL/6J, sort) med en dosis ENU på 3 × 100 mg/kg. (B) Deletionsskemaet. Når de ENU-behandlede hanner har genvundet deres frugtbarhed, parres de med homozygote Re/Re-hunner. Re-mutationen markerer det ikke-mutageniserede kromosom, med det forbehold, at der kan forekomme rekombination mellem en ny knyttet mutation og Re . G1-dyr, der er heterozygote for ENU-mutageniserede kromosomer og Re, parres med mus, der er hemizygote for en gulmærket deletion. De resulterende klasser af afkom kan let identificeres: (i) mutantklassen er gul og ligehåret og angiver, hvis den mangler, sandsynligheden for en dødelig mutation; (ii) en bærerklasse, der er wild-type, og som kan anvendes til at genvinde eventuelle dødelige mutationer; (iii) to krøllede musklasser (sort og gul), der ikke er informative og straks kan kasseres. ( C ) Inversionsordningen. Balancer-kromosomet indeholder en inversion, der undertrykker rekombination over et rimeligt interval på 20-30 cM, er markeret med det dominerende K14-agouti-transgen, der giver gul pelsfarve, og er homozygot dødelig på grund af afbrydelse af et eller flere dødelige gener ved dets endepunkter. Når de ENU-behandlede hanner har genvundet deres frugtbarhed, parres de med hunner, der bærer balancerkromosomet (gult). G1-dyr, der er gule, parres med dyr, der er heterozygote for balancer-kromosomet og Re (gulplettet). Der kan identificeres tre klasser af afkom i anden generation, og den fjerde klasse, som er homozygot for balancer-kromosomet, dør (opadvendt). De nyttige G2-dyr er de gule, ligehårede dyr, som er broder-søster-parret. G3-afkommet er let at klassificere som: (i) wildtypemutantklassen, som, hvis den mangler, indikerer sandsynligheden for en forbundet dødelig mutation, og (ii) en bærerklasse, der anvendes til at redde eventuelle dødelige mutationer, og som bærer den balancerede punktmutation og er ideel til opretholdelse af bestanden.
( A ) Generering af kromosomomrearrangementer ved hjælp af Cre /loxP . Der er konstrueret to lambda-mus-genombiblioteker, som indeholder de selekterbare markører, der er nødvendige for totrins målretning af begivenheder. Det ene indeholder den selekterbare markør neomycin ( Neo ), 5′-enden af hypoxanthinphosphoribosyltransferase ( Hprt ), et loxP-sted og Tyrosinase-minigenet ( Ty ). Det andet bibliotek indeholder den selekterbare markør puromycin ( Puro ), 3′-enden af Hpr , et loxP-sted og K14-Agouti-transgenet ( Ag ). Hvis loxP-stederne indsættes i cis i samme retning, vil rekombination efter Cre-transfektion give en deletion og HAT-resistente, Puro-følsomme, Neo-følsomme ES-celler. Hvis loxP-stederne er indsat i modsat retning, vil rekombination efter Cre-transfektion resultere i en inversion med HAT-resistente, Puro-resistente, Neo-resistente ES-celler. (B og C) Mutageneseskemaer for musekromosom 11 ved hjælp af kromosomomale rearrangementer med gul pelsfarve. Deletionen eller inversionen er mærket med en dominerende gul pelsfarvemarkør, K-14-agouti (gul). Hvert skema anvender den dominerende Rex ( Re , og angivet ved det sorte kromosom) mutation på Chr 11, som forårsager krøllet pels (meleret). I hvert skema injiceres wild-type hanner (C57BL/6J, sort) med en dosis ENU på 3 × 100 mg/kg. (B) Deletionsskemaet. Når de ENU-behandlede hanner har genvundet deres frugtbarhed, parres de med homozygote Re/Re-hunner. Re-mutationen markerer det ikke-mutageniserede kromosom, med det forbehold, at der kan forekomme rekombination mellem en ny knyttet mutation og Re . G1-dyr, der er heterozygote for ENU-mutageniserede kromosomer og Re, parres med mus, der er hemizygote for en gulmærket deletion. De resulterende klasser af afkom kan let identificeres: (i) mutantklassen er gul og ligehåret og angiver, hvis den mangler, sandsynligheden for en dødelig mutation; (ii) en bærerklasse, der er wild-type, og som kan anvendes til at genvinde eventuelle dødelige mutationer; (iii) to krøllede musklasser (sort og gul), der ikke er informative og straks kan kasseres. ( C ) Inversionsordningen. Balancer-kromosomet indeholder en inversion, der undertrykker rekombination over et rimeligt interval på 20-30 cM, er markeret med det dominerende K14-agouti-transgen, der giver gul pelsfarve, og er homozygot dødelig på grund af afbrydelse af et eller flere dødelige gener ved dets endepunkter. Når de ENU-behandlede hanner har genvundet deres frugtbarhed, parres de med hunner, der bærer balancerkromosomet (gult). G1-dyr, der er gule, parres med dyr, der er heterozygote for balancer-kromosomet og Re (gulplettet). Der kan identificeres tre klasser af afkom i anden generation, og den fjerde klasse, som er homozygot for balancer-kromosomet, dør (opadvendt). De nyttige G2-dyr er de gule, ligehårede dyr, som er broder-søster-parret. G3-afkommet er let at klassificere som: (i) wildtypemutantklassen, som, hvis den mangler, indikerer sandsynligheden for en forbundet dødelig mutation, og (ii) en bærerklasse, der anvendes til at redde eventuelle dødelige mutationer, og som bærer den balancerede punktmutation og er ideel til opretholdelse af bestanden.
Efterhånden som der udvikles nye teknologier til påvisning af enkeltnukleotidpolymorfisme med højt gennemløb, vil teknologier til påvisning af punktmutationer blive enklere ( 30 , 31 ). I modsætning til mennesker er naturligt forekommende polymorfismer sjældne i indavlede musestammer, især inden for kodningsregioner. Det er således muligt at påvise punktmutationer i en indavlet stamme, hvilket gør mutationsdetektion med mismatchreparationsenzymer til en potentiel metode til hurtigt at kortlægge og identificere læsionerne.
Screening for sygdomsfænotyper
I enhver screening for mutationer ved hjælp af ENU er mutationsisolering afhængig af fænotypeassayet, hvilket kræver, at den mutante fænotype skal variere betydeligt fra baggrunden. Screening for mutationer indebærer imidlertid analyse af mange dyr, og derfor skal phenotypescreeningen være bred og billig. Synlige fænotyper, der påvirker øjet, pelsen, størrelsen eller den neurologiske adfærd, er lette at identificere, og sådanne screeninger giver ofte nye mutationer. Adfærds- og sanseorganfænotyper kan undersøges ved hjælp af standardtests for reflekser, syns- eller høretab, motorisk udvikling, balance og koordination samt indlæring og hukommelse. Skeletudvikling og morfologi af blødt væv kan undersøges ved hjælp af røntgenanalyse med høj opløsning og lav energi. Kliniske test udført på museblod kan give en lang række fænotyper, der er relevante for kliniske sygdomme hos mennesker, selv om test udført på musekropsvæsker skal udføres i mikroskala. På grund af de eksisterende mikroskalaforsøg for menneskelige spædbørn er der allerede mange kliniske forsøg til rådighed. En komplet blodtælling med mikroskopisk differentialanalyse kan identificere abnormiteter i antallet af røde og hvide blodlegemer eller i morfologien samt abnormiteter i blodpladerne. En udvidelse af analysen af blodceller med flowcytometri kan afsløre andre immunologiske defekter. Ved kvantificering af antinukleære antistoffer kan man påvise autoantistoffer i serum ved en lang række autoimmune sygdomme, herunder systemisk lupus erythematosus. Klinisk-kemiske test kan diagnosticere adskillige anomalier i organsystemerne, herunder lever-, bugspytkirtel-, hjerte- og nyresygdomme. Urinanalyse af mus afslører forhøjede niveauer af protein eller andre unormale biprodukter fra sygdom. Tandem-massespektrometri kan påvise en række stofskiftesygdomme, der påvirker lipider, fedtsyrer eller aminosyrer. Der er ved at blive udviklet yderligere assays til at identificere neurologiske, kardiovaskulære, hæmatopoietiske og immunfænotyper ved hjælp af højtydende teknologier som f.eks. mikroarrays.
En mutantmusressource. I første omgang vil en mutantmusressource på Baylor College of Medicine blive udviklet for musekromosom 11, og den anvendes her som en demonstration af de typer af genetiske ressourcer, der vil være tilgængelige i musen. Ideelt set vil sådanne ressourcer blive udviklet for andre musekromosomer. Mutantressourcen vil bestå af en række forskellige mutationer, herunder punktmutationer induceret af ENU, målrettede genforstyrrelser og indsættelser samt genetiske reagenser som f.eks. deletioner og inversioner. Disse mutationer vil udgøre et funktionelt kort over kromosomet og vil blive lokaliseret i molekylære intervaller, så de kan forankres i det fysiske kort, der består af BAC- og YAC-kontigs. Når musens genom er sekventeret, kan mutationerne korreleres med kandidatgener, der ligger inden for de molekylære intervaller.
En mutantmusressource. I første omgang vil der blive udviklet en mutantmusressource på Baylor College of Medicine for musekromosom 11, og den anvendes her som en demonstration af de typer af genetiske ressourcer, der vil være tilgængelige i musen. Ideelt set vil sådanne ressourcer blive udviklet for andre musekromosomer. Mutantressourcen vil bestå af en række forskellige mutationer, herunder punktmutationer induceret af ENU, målrettede genforstyrrelser og indsættelser samt genetiske reagenser som f.eks. deletioner og inversioner. Disse mutationer vil udgøre et funktionelt kort over kromosomet og vil blive lokaliseret i molekylære intervaller, så de kan forankres i det fysiske kort, der består af BAC- og YAC-kontigs. Når musegenomet sekventeres, kan mutationerne korreleres med kandidatgener, der ligger inden for de molekylære intervaller.
Generering af ressourcer til mutantmus
Genereringen af et stort antal mutationer vil skabe nye etiske og videnskabelige spørgsmål inden for musesamfundet: der vil være behov for nye databaser og fænotypeassays, omkostningseffektiv genindsamling af mutationer fra kryopreserveret eller frysetørret sæd vil blive afgørende, og der vil opstå problemer med dyrepleje og omkostninger. Disse bestræbelser kræver en enorm investering i museressourcer.
Genetiske ressourcer
En af de mest kraftfulde genetiske ressourcer, der i øjeblikket er til rådighed hos musen, er indavlsstammerne. En yderligere definition af den genetiske diversitet i disse stammer er en af musesamfundets prioriteter, og der er en indsats i gang for at udvikle en database over stammeegenskaber. Dette kræver analyse af indavlsstammerne for mange fænotypiske parametre, herunder klinisk hæmatologi og kemi, patologi, adfærd og fysiologi.
Vedligeholdelse, analyse og kortlægning af et stort antal mutationer i mus vil kræve generering af genetiske ressourcer for at sænke omkostningerne og reducere fejltagelser. Der udvikles genetiske reagenser som f.eks. deletioner ved hjælp af en række forskellige metoder, herunder Cre/ loxP og stråling ( 22 , 23 , 25 , 32 , 33 ). Balancer-kromosomer kan i øjeblikket genereres hurtigt og effektivt ved hjælp af Cre/loxP-metoder ( 24 , 25 ). Transgene mus, der indeholder humane YAC’er eller BAC’er, kan være nyttige i komplementerings- og redningsundersøgelser ( 34 ). Da mutantfænotyper kan variere på forskellige indavlede stammebaggrunde, bør genetiske reagenser også vedligeholdes på standard genetiske baggrunde.
Arkivering
Generering af et stort antal musestammer kræver effektiv arkivering og rekonstituering af stammerne. Opbevaring af museembryoner ved kryokonservering er en effektiv teknik, som allerede har været anvendt i over ti år. For nylig har succeser med kryokonservering af sædceller gjort det til en teknik, der kan anvendes ( 35-37 ). Musesæd kan navnlig anvendes til at genskabe stammer ved hjælp af en række assisterede reproduktionsteknologier: kunstig befrugtning, in vitro-befrugtning og intracytoplasmatisk sædinjektion (ICSI) ( 38 ). Den vellykkede rekonstituering af musestammer fra frysetørret sæd ved hjælp af ICSI kan give en anden metode til arkivering og genoplivning af musestammer ( 39 ).
Databaser
Der er allerede behov for databaser til håndtering af genetiske og fænotypiske data om mus. Den primære musedatabase er Mouse Genome Database, der er placeret på Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME; http://www.informatics.jax.org ), som omfatter et Mouse Locus Catalogue, der beskriver eksisterende musemutanter og indeholder omfattende kortoplysninger, der beskriver deres placering. For at forenkle søgningen efter muterede mus er der for nylig blevet udviklet en international musestammeressource ( 40 ), som findes på to websteder: Jackson Laboratory på www.jax.org/pub-cgi/imsrlist og MRC, Harwell, på imsr.har.mrc.ac.uk/. Desuden vil der sandsynligvis blive akkumuleret store mængder af fænotypedata om et stort antal mutantmusestammer, hvilket skaber behov for fænotypedatabaser, der kan forbindes med kortlægnings- og mutagenesedatabaser.
Distribution
For at stille en genetisk ressource til rådighed for samfundet skal mutante mus være let tilgængelige. Selv om mange mutantbestande er tilgængelige fra kommercielle leverandører eller fra Jackson Laboratory, er der behov for yderligere distributionscentre. For at imødekomme denne efterspørgsel vil flere NIH-finansierede Mutant Mouse Resource Centers fungere som lagerarkiver og distributionscentre for de forskellige regioner i USA. Det europæiske mutantmusarkiv med knudepunkter i Monteretondo (Roma, Italien), CNRS (Orleans, Frankrig), Gulbenkian-instituttet (Lissabon, Portugal) og Karolinska Instituttet (Huddings, Sverige) er en ressource for den europæiske indsats. Disse ressourcecentre er beregnet til at distribuere alle typer mutantmusestammer.
Fremtiden ser lys ud
Der vil i løbet af det næste årti blive genereret et stort antal mutantmusestammer, som vil omfatte mus med deletioner, duplikationer, balanceringskromosomer, målrettede forstyrrelser, genfælder, retrovirale eller transgene indsættelser og punktmutationer. Samlingen af disse mutationer i en mutantmusressource vil kræve, at deres placering på kortet i musen raffineres, og at deres placering i mennesket forudsiges. Mutationerne vil generere et funktionelt kort over genomet, som kan korreleres med sekvens- og transkriptkortet for at tilvejebringe en rig ressource af funktionelle oplysninger ( fig. 3 ). Der er allerede blevet produceret et stort antal ENU-inducerede mutationer, som kun repræsenterer en brøkdel af pattedyrgenomets mutationspotentiale, og yderligere eksperimenter vil generere nye menneskelige sygdomsmodeller og afsløre nye udviklingsveje for pattedyr. Vores opfattelse af genfunktionen hos pattedyr vil blive ændret dramatisk og permanent af disse eksperimenter, hvilket vil få stor betydning for udviklingen af lægemidler og menneskers sundhed.
Anerkendelser
Forfatterne takker Yin-Chai Cheah for hjælp til færdiggørelse af manuskriptet. Arbejdet med Chromosome 11 er finansieret af US Department of Public Health grant P01 CA75719. A.B. er forsker ved Howard Hughes Medical Institute.
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
>
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
pg.
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
pg.
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
.
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)