Výsledky

Původně jsme prokázali, že podání cykloheximidu v těsné blízkosti indukce pilokarpinového SE zablokovalo supragranulární MFS u potkanů – nezabránilo však následnému rozvoji spontánních záchvatů ani neovlivnilo jejich frekvenci. Tyto výsledky poprvé poskytly přímý důkaz proti kauzální roli supragranulární MFS v epileptogenezi temporálního laloku. Jedním z možných vysvětlení této disociace je, že generace záchvatů v pilokarpinovém a kainátovém modelu epilepsie by mohla být řízena z extrahipokampálních zdrojů. V řadě studií byl totiž naznačen relativní podíl thalamu, amygdaly a piriformní kůry na iniciaci spontánních záchvatů v těchto modelech.

K řešení této otázky jsme dále použili intrahipokampální aplikaci malé dávky kyseliny kainové. I zde dokázal cykloheximid u většiny zvířat zcela zablokovat supragranulární MFS, aniž by se změnila frekvence a intenzita spontánních iktálních a interiktálních EEG příhod. Došli jsme k závěru, že ani v intrahipokampálním modelu s malou dávkou kainátu, kde spontánní záchvaty s větší pravděpodobností začínaly v injektovaném hipokampu, není supragranulární MFS pro vznik iktálních příhod nezbytná.

Vzhledem k tomu, že většina našich analýz v počátečních experimentech hodnotila zvířata 2 měsíce po počátečním precipitujícím poškození, snažili jsme se poté zjistit, jak by supragranulární MFS ovlivnily spontánní záchvaty. Některé publikace na toto téma ukázaly, že zvířata s častějšími záchvaty mají intenzivnější supragranulární MFS, což naznačuje, že tato forma synaptické reorganizace nějak souvisí s větší náchylností k záchvatům (i když neurčuje, zda se záchvaty objeví, či nikoli). Jiní badatelé tvrdí, že hustota supragranulární MFS nesouvisí s celkovým počtem celoživotních záchvatů ani s frekvencí záchvatů (u experimentální nebo lidské epilepsie temporálního laloku), a mnoho autorů již nepovažuje MFS za nutnou nebo postačující událost u epilepsie temporálního laloku. U člověka však nemáme kontrolu nad stavem tkáňového pozadí. A ve většině experimentálních studií byl pro vznik záchvatů nutný SE – kde není pochyb o tom, že supragranulární MFS je do značné míry odrazem předcházející epizody SE. Vytvořením experimentální podmínky, v níž z počáteční epizody SE nevyplývala žádná supragranulární MFS, jsme mohli zkoumat relativní podíl následných spontánních záchvatů na této synaptické reorganizaci. Došli jsme k závěru, že supragranulární MFS nevykazuje žádnou souvislost s frekvencí spontánních záchvatů a zdá se, že kritičtěji závisí na době po počátečním poškození. Za těchto podmínek se totiž supragranulární MFS nakonec vyvinula u všech zvířat, i když mnohem pomaleji; dále se nezdálo, že by byla robustnější u zvířat s větší frekvencí opakovaných spontánních záchvatů.

Popis disperze granulárních buněk v lidské tkáni od pacientů s epilepsií temporálního laloku dal podnět k domněnce, že vývojové změny by mohly být základem následné epilepsie u těchto pacientů. Prokázání, nejprve na krysím modelu s pilokarpinem a později u myší léčených kainátem, že u dospělých hlodavců se může vyvinout disperze granulárních buněk, naznačilo, že tyto cytoarchitetonické změny mohou být také důsledkem počáteční precipitující epizody SE. Následné prokázání, že neurogeneze buněk dentátových granulí byla po SE zvýšena, představilo další možnost – že plasticita hipokampální sítě spojená s epileptogenezí by mohla vzniknout z aberantních spojení vytvořených nově narozenými buňkami dentátových granulí. Zkoumali jsme proto, zda cykloheximid ovlivní nástup supragranulární MFS prostřednictvím blokování neurogeneze granulárních buněk. K našemu překvapení jsme pozorovali, že proliferace buněk v DG je u epileptických zvířat léčených cykloheximidem dramaticky zvýšena. Indukce SE u zvířat, kterým byl aplikován samotný pilokarpin, vedla k 2-7násobnému zvýšení mitotické rychlosti buněk dentátových granul ve srovnání s 5-30násobným zvýšením u zvířat léčených pilokarpinem/cykloheximidem. Předpokládali jsme, že takové zvýšení mitotické rychlosti souvisí s ochranou zranitelné prekurzorové buněčné populace, která by jinak po pilokarpinem vyvolaném SE degenerovala, cykloheximidem. Dále jsme naznačili, že MFS a neurogeneze granulárních buněk spolu nemusí nutně souviset. Tato disociace je v souladu se zjištěním, že ozáření zvířat vystavených pilokarpinem indukovanému SE v podstatě zrušilo neurogenezi dentátových granulových buněk, ale nezabránilo reorganizaci mechových vláken v dentátové molekulární vrstvě.

Celobuněčné patch-clamp záznamy v hipokampálních řezech ukázaly, že amplituda a frekvence spontánních excitačních postsynaptických proudů v granulových buňkách se po léčbě kainátem s časem zvyšuje. Tento zvýšený excitační synaptický vstup koreloval s intenzitou Timmova barvení ve vnitřní molekulární vrstvě. Když byla inhibice snížena bikukulinem v řezech od zvířat léčených kainátem, záblesková fotolýza klecového glutamátu aplikovaná ve vrstvě granulových buněk vyvolala epileptiformní výbuchy akčních potenciálů (účinek, který nebyl pozorován u granulových buněk kontrolních potkanů). Tato data podpořila hypotézu, že supragranulární MFS vyvolaná kainátem vede k postupné tvorbě aberantních excitačních spojení mezi granulárními buňkami. K vyhodnocení změn v elektrofyziologickém profilu, které by byly důsledkem léčby cykloheximidem, byla provedena elektrofyziologie in vitro (extracelulární záznamy) 2 měsíce po pilokarpinem indukované SE. Evokované potenciály v řezech potkanů léčených pilokarpinem a pilokarpinem/cykloheximidem vykazovaly polyspikery malé amplitudy (epileptiformní odpovědi) v CA1 a zřejmě normální izolovaný populační hrot v DG. Ještě důležitější je, že DG v řezech od zvířat užívajících pilokarpin a pilokarpin/cykloheximid se nelišila, pokud jde o elektrofyziologické abnormality, a to ani při vysokém K+ nebo vysokém K+/bikulinu. Analýza neo-Timmova barvení podle očekávání odhalila silnou supragranulární MFS u potkanů s pilokarpinem a výrazně menší barvení u potkanů s pilokarpinem/cykloheximidem. Výskyt abnormálních reakcí na podněty a epileptiformní aktivity vyvolané vysokým K+ nebo vysokým K+/bicucullinem tedy nezávisí na stupni supragranulární MFS.

Jednou z dlouhodobých otázek týkajících se vývoje MFS u zvířecích modelů SE je, zda by narostlá mechová vlákna přidala k dendritům v molekulární vrstvě nové synapse – nebo zda tato narostlá vlákna jednoduše nahradila uvolněné synapse (v důsledku degenerace hilových buněk). Většina studií na toto téma totiž naznačuje, že ztráta hilových mozkových buněk, které jsou za normálních okolností hlavním hilovým cílem mozkových vláken z granulárních buněk, je důležitým faktorem při iniciaci supragranulární MFS. Pilokarpinem indukovaný SE v přítomnosti cykloheximidu vedl ke snížení počtu poškozených hilových buněk ve srovnání s potkany, kteří nebyli předem ošetřeni cykloheximidem. Předpokládané mozkové buňky, identifikované pomocí imunohistochemie peptidu souvisejícího s kalcitoninovým genem (CGRP), nebyly 60 dní po SE významně sníženy v žádné ze skupin (vzhledem ke zdánlivému rozporu tohoto nálezu s převahou důkazů svědčících o úbytku mozkových buněk SE předpokládáme, že CGRP může představovat marker subpopulace mozkových buněk). Zatímco kontroly měly ve vnitřní molekulární vrstvě silný pás CGRP pozitivních vláken (předpokládané axony mechových buněk) a žádná vlákna obarvená neo-Timmem, potkani léčení pilokarpinem neměli žádná CGRP vlákna a silné barvení neo-Timmem. Naproti tomu zvířata léčená cykloheximidem a pilokarpinem měla CGRP a neo-Timm barvení podobné jako kontroly. Došli jsme k závěru, že cykloheximid může chránit hilové CGRP-pozitivní buňky během SE; tím, že těmto buňkám umožní zachovat si normální axonální projekci, zabrání MFS – což je scénář v souladu s hypotézou „dráždivých“ mozkových buněk, která počítá s přežíváním mozkových buněk pro hyperexcitabilitu sítě. Předpokládali jsme, že cykloheximid zabraňuje supragranulárnímu MFS vyvolanému SE tím, že zabraňuje ztrátě hilových CGRP-pozitivních buněk (předpokládaných mossy buněk).

Skutečnost, že cykloheximid chránil hilové buňky a dále zvyšoval proliferaci buněk v DG po SE, vytvořila podmínky pro hypotézu, která integruje současná pozorování. Badatelé prokázali, že některé nově vzniklé granulární buňky se vyvíjejí v abnormálních místech v rámci hilu. Tyto ektopické granulární buňky vykazují pravidelné výbuchy akčních potenciálů, které jsou synchronizovány s výboji pyramidových buněk CA3 a výboji hilových neuronů (včetně mechových buněk). Kromě vzniku ektopických hilových granulárních buněk charakterizovalo několik článků vznik hilových bazálních dendritů na granulárních buňkách u epileptických zvířat. Oba tyto rysy jistě umožňují vznik aberantních synapsí v hilu, a to buď ektopickými nebo dráždivými buňkami, nebo aberantními bazálními dendrity, což může být příčinou změn hyperexcitability – bez ohledu na přítomnost supragranulární MFS.

.